Desarrollo de un marcador negativo seleccionable para Entamoeba histolytica</em

1. FCU sistema de selección negativa en Entamoeba histolytica La línea de control de vectores (HM1 / pKT3M) y la línea experimental (HM1/pKT3M-FCU1) fueron generados por 1,2 se ha descrito anteriormente técnicas. Semillas de las líneas de estudio de los tubos de valores en T-25 frascos y mantener la selección mediante la adición de antibiótico apropiado (12 mg / ml de G418) en TYI-S-33 3 medianas. Los frascos deben ser del 70-80% confluente después de 16-18 horas de crecimiento a 37 ° C. Prepare una solución fresca de valores de 50 mm de 5-fluorocitosina (5-FC, Sigma) en agua tibia TYI-S-33. Vortex rigurosamente durante varios minutos para disolver 5-FC por completo. Filtro a esterilizar la solución stock de pasar por un filtro de 0,22 micras. Trofozoítos de la cosecha mediante la colocación de las botellas en hielo durante 3-5 minutos y la recolección de las células por centrifugación a 200xg durante 5 minutos a temperatura ambiente. Resuspender el precipitado en medio fresco TYI y el recuento de las células. Diseño de un experimento típico utiliza 0,5 x 10 4 células por pocillo de una placa de 48 y en un volumen final de 1 ml, y se repite por triplicado para cada condición de prueba. Además, para facilitar las mediciones de fluorescencia, un plato aparte se utiliza para cada cepa por cada punto del tiempo. Semillas de 0,5 x 10 4 células por pocillo para cada prueba 5-FC concentración, por triplicado. Mantener la presión de selección de antibióticos en el medio TYI. Ahora agregue la cantidad necesaria de 5-FC solución madre y trofozoítos a cada pocillo. Las placas se incuban en una bolsa anaeróbica a 37 º C. 2. Determinación de la eficiencia de la selección Prepare 2 mg / ml de solución de archivo de la célula de seguimiento verde CMFDA (Invitrogen) en DMSO. Para hacer la solución de trabajo diluir la acción de 1000 veces en medio libre de suero TYI. Se elimina el medio totalmente de placas de cultivo de trofozoíto y reemplazar con 150 l de suero libre de CMFDA TYI contiene. Continuar la incubación a 37 ° C durante 1 hora. Retire la solución de colorante de los pozos y leer la placa en la espectrofluorómetro Spectramax M2 microplacas. La longitud de onda de excitación se debe establecer a 492 nm y la emisión de fluorescencia leer a 517 nm. Comparar los valores de fluorescencia para el control de las células frente a los transfectantes de prueba. Seguir leyendo las placas en cada intervalo de tiempo. Uso positivo adecuado (TYI solamente) y negativos (25 mg / ml de higromicina) pozos de control en cada plato. 3. Resultados representante La E. transfectantes histolytica mostró sólida expresión de codón optimizado FCU1 recombinante (Figura 1). Cuando este protocolo se sigue correctamente el resultado es la eliminación selectiva de E. histolytica células que expresan FCU1 en presencia de 0,5 mM 5-fluorocitosina. Control de las células, por el contrario seguirá creciendo normalmente en concentraciones de hasta 5 mm de 5-FC y llegar a la confluencia entre el 72 y 96 horas (Figura 2-a). El FCU1 células portadoras a las 48 horas está completamente lisadas en los pozos de tratamiento se observan bajo el microscopio. Estos también muestran una disminución de la fluorescencia cuando se tiñen con los colorantes vitales CMFDA, que se utiliza en los estudios cuantitativos participación de gran número de muestras (figura 2-b). El sistema FCU1/5-FC es una herramienta de selección negativa eficaz y potente para E. histolytica trofozoítos. Figura 1. Generación de E. histolytica HM1 transfectantes que expresan marcador de selección negativa (A) proteínas recombinantes FCU1 se detectó en un Western blot utilizando anticuerpos anti-c-Myc (panel superior). Como era de esperar, una banda de 42kDa podrían ser detectados (que se muestra con una flecha) en el lisado total de los transfectantes FCU, pero no en el vector solo transfectantes control. La imagen inferior muestra la misma mancha probaron con anticuerpos contra la actina como control de carga. (B) Los resultados de la PCR cuantitativa en tiempo real que muestra la expresión de ARNm específicos FCU1 normalizado a lgl4 control. Figura 2. Fármacos in vitro la sensibilidad de E. histolytica transfectantes que expresan marcador de selección negativa Las curvas de supervivencia de los transfectantes control (a) y (b) transfectantes FCU1 expresar cultivadas en 48 y placa. Las células fueron cultivadas en presencia de concentraciones crecientes del profármaco-5-fluorocitosina, la supervivencia celular se cuantificó por tinción CMFDA en cada intervalo de tiempo indicado en el eje X. El eje Y representa unidades de fluorescencia y es un reflejo directo de la población de células sobrevivientes. Tenga en cuenta que la FCU1 transfectantes que expresan mostró una sensibilidad significativa en la concentración de 0,5 mM profármaco en comparación con el control. No se observaron células en el punto 120 horas de tiempo en estos pozos como comcomparación con el crecimiento confluente visto en los pozos de control correspondiente al microscopio (datos no mostrados). Hygro denota 25μg / ml de higromicina utilizó como control negativo.