Ontwikkeling van een negatieve selecteerbare marker voor Entamoeba histolytica</em

1. FCU negatieve selectie System in Entamoeba histolytica De vector controle lijn (HM1 / pKT3M) en de experimentele lijn (HM1/pKT3M-FCU1) werden gegenereerd door de eerder beschreven technieken 1,2. Zaad van de lijnen onder studie van de voorraad buizen in T-25 kolven en te onderhouden selectie door het toevoegen van geschikte antibioticum (12 ug / ml G418) in TYI-S-33 3 medium. De kolven moet 70-80% samenvloeiende na 16-18 uur van de groei op 37 ° C. Bereid een verse voorraad 50 mM oplossing van 5-fluorocytosine (5-FC, Sigma) in warm TYI-S-33 medium. Vortex rigoureus een aantal minuten volledig op te lossen 5-FC. Filter-Steriliseer de stock-oplossing door het door een 0,22 urn filter. Oogst trofozoïeten door het plaatsen van de kolven op ijs gedurende 3-5 minuten en het verzamelen van de cellen door centrifugeren bij 200xg gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Resuspendeer de pellet in verse TYI medium en tel de cellen. Ontwerp van een typisch experiment maakt gebruik van 0,5 x 10 4 cellen per putje van een 48 wells plaat in een eindvolume van 1 ml, of drie herhalingen voor elke test conditie. Bovendien, om te bevorderen fluorescerende metingen, is een aparte plaat gebruikt voor elke stam per tijdstip. Zaad 0,5 x 10 4 cellen per well voor elke test 5-FC concentratie, in drievoud. Handhaaf het antibioticum selectie druk in de TYI medium. Voeg nu de benodigde hoeveelheid van 5-FC stockoplossing aanwezig zijn en trofozoïeten aan elk putje. Incubeer de platen in een anaërobe zak bij 37 ° C. 2. Bepaling van de Selectie-efficiëntie Bereid 2 mg / ml stockoplossing van Cell tracker groene CMFDA (Invitrogen) in DMSO. Om de werkende oplossing te verdunnen de voorraad 1000-voudige in serum-vrij TYI medium. Volledig verwijderen van het medium uit trophozoite cultuur platen en te vervangen door 150 pi serum-vrij TYI met CMFDA. Ga door incubatie bij 37 ° C gedurende 1 uur. Verwijder de kleurstof oplossing uit putten en lees de plaat in de Spectramax M2 microplaat Spectrofluorometer. De excitatie golflengte moet worden vastgesteld op 492 nm en de fluorescentie-emissie te lezen bij 517 nm. Vergelijk de fluorescentie waarden voor de controle cellen ten opzichte van de test transfectanten. Ga door het lezen van de platen op elk tijdsinterval. Gebruik de juiste positieve (TYI alleen) en negatieve (25 ug / ml hygromycine) controle putten in elk bord. 3. Representatieve resultaten De E. histolytica transfectanten toonde sterke expressie van codon-geoptimaliseerde recombinant FCU1 (figuur 1). Wanneer dit protocol correct wordt nageleefd dit resulteert in selectieve eliminatie van E. histolytica cellen die FCU1 in aanwezigheid van 0,5 mM 5-fluorocytosine. Controle cellen, blijven in tegenstelling tot normaal groeien tot 5 mM concentratie van 5-FC en de samenvloeiing te bereiken tussen 72 en 96 uur (figuur 2-a). De FCU1 die cellen op 48 uur volledig gelyseerd wanneer de behandelde putten worden bekeken onder een microscoop. Deze tonen ook af fluorescentie na kleuring met de vitale kleurstof CMFDA, die wordt gebruikt in kwantitatieve studies waarbij grote aantal monsters (figuur 2-b). Het FCU1/5-FC systeem is een effectieve en krachtige negatieve selectie tool voor E. histolytica trofozoïeten. Figuur 1. Generatie van E. histolytica HM1 transfectanten uiten van negatieve selecteerbare marker (A) FCU1 recombinant eiwit werd ontdekt op een western blot met behulp van anti-c Myc antilichaam (bovenste paneel). Zoals verwacht, zou een 42kDa band worden gedetecteerd (aangegeven door een pijl) in de totale lysaat van de FCU transfectanten, maar niet in de vector alleen controle transfectanten. Het onderste paneel toont dezelfde blot onderzocht met anti actine antilichaam als een laad controle. (B) De resultaten van de kwantitatieve real-time PCR met de expressie van specifieke mRNA FCU1 genormaliseerd tot lgl4 te controleren. Figuur 2. In vitro drug gevoeligheid van E. histolytica transfectanten uiten van negatieve selecteerbare marker Overlevingscurven van (een) controle transfectanten en (b) FCU1 uitdrukken transfectanten gekweekt in 48-well plaat. De cellen werden gekweekt in aanwezigheid van toenemende concentraties van de prodrug-5-fluorocytosine; overleving van de cel werd gekwantificeerd door CMFDA vlekken op elk tijdsinterval zoals aangegeven op de X-as. De Y-as staat voor fluorescentie-eenheden en is een directe weerspiegeling van de overlevende celpopulatie. Houdt u er rekening mee dat de FCU1 uiten transfectanten significant gevoeligheid toonde bij 0,5 mm prodrug concentratie in vergelijking met de controlegroep. Geen cellen werden waargenomen op 120h tijdstip in deze putten als comvergeleken aan de samenvloeiing groei zien in de bijbehorende controle putten onder de microscoop (gegevens niet getoond). Hygro duidt 25μg / ml hygromycine gebruikt als een negatieve controle.