Ex vivo Expansion von Tumor-reaktiven T-Zellen mittels Bryostatin 1/Ionomycin und der Gemeinsamen gamma-Kette Zytokine Formulation
Summary
Ein effizientes Protokoll für die<em> Ex vivo</em> Ausbau der Tumor-reaktiven T-Zellen aus Tumor-drainierenden Lymphknoten oder anderen sekundären lymphatischen Gewebe des tumortragenden Gastgeber beschrieben. Dieses Protokoll selektiv erweitert tumor-spezifische T-Zellen für den Einsatz in adoptiven Immuntherapie von Brustkrebs.
Abstract
Es wurde berichtet, dass Brustkrebs-Patientinnen bereits bestehende Immunantworten gegen ihren Tumoren 1,2 haben. Allerdings scheitern solche Immunantwort auf einen vollständigen Schutz gegen die Entwicklung oder Wiederauftreten von Brustkrebs bieten. Zur Lösung dieses Problems durch die Erhöhung der Häufigkeit von Tumor-reaktiven T-Zellen hat adoptiven Immuntherapie eingesetzt. Eine Vielzahl von Protokollen für die Expansion von Tumor-spezifischen T-Zellen verwendet wurden. Diese Protokolle sind jedoch die Verwendung von Tumor-Antigenen ex vivo für die Aktivierung von Antigen-spezifischen T-Zellen beschränkt. Vor kurzem haben gemeinsame gamma-Kette Zytokine wie IL-2, IL-7, IL-15 und IL-21 wurden allein oder in Kombination zur Verbesserung der Anti-Tumor-Immunantwort 3 verwendet. Es ist jedoch nicht klar, was Formulierung am besten für die Expansion von Tumor-reaktiven T-Zellen. Hier präsentieren wir ein Protokoll für die selektive Aktivierung und Expansion von Tumor-reaktiven T-Zellen aus dem FVBN202 transgenen Mausmodell der HER-2/neu positiven Mammakarzinoms für den Einsatz in adoptiven T-Zell-Therapie von Brustkrebs. Das Protokoll umfasst die Aktivierung von T-Zellen mit bryostatin-1/ionomycin (B / I) und IL-2 in Abwesenheit von Tumor-Antigenen für 16 Stunden. B / I Aktivierung imitiert intrazelluläre Signale, die sich in T-Zell-Aktivierung durch die Erhöhung Proteinkinase C Aktivität und den intrazellulären Kalzium-, bzw. 4. Dieses Protokoll ausdrücklich aktiviert tumor-spezifische T-Zellen, während das Töten irrelevant T-Zellen. Die B / I-aktivierten T-Zellen werden mit IL-7 und IL-15 für 24 Stunden kultiviert und anschließend mit IL-2 gepulst. Nach 24 Stunden, T-Zellen werden gewaschen, halbiert und mit kultivierten IL-7 + IL-15 für weitere 4 Tage. Tumor-Spezifität und anti-Tumor-Wirksamkeit des ex vivo expandierten T-Zellen bestimmt.
Protocol
Discussion
Selektiver Ausbau von Tumor-reaktiven T-Zellen mit Effektorfunktionen Anti-Tumor-Funktion kann durch das vorgeschlagene Protokoll mit B erreicht werden / I Aktivierung und ex vivo Expansion mit der gamma-Kette Zytokine IL-2, IL-7 und IL-15. Während IL-2 ist ein T-Zell-Wachstumsfaktor, der die Differenzierung und Expansion von Antigen-spezifischen T-Zellen unterstützt, können IL-7 inhibiert die Apoptose von T-Zellen und unterstützen ihre Lebensfähigkeit während der Expansion. IL-15 unterstützt Memory T-Ze…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Diese Arbeit wurde vom NIH R01 CA104757 Grant (MH Manjili) unterstützt. Wir danken für die Unterstützung der VCU Massey Cancer Center und dem Commonwealth Foundation for Cancer Research.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Bryostatin 1 | Sigma | B7431-10ug | ||
| Ionomycin | Calbiochem | 407950 | ||
| Mouse IL-7 | PeproTech | 217-17 | ||
| Mouse IL-15 | PeproTech | 210-15 | ||
| Human IL-2 | PeproTech | 200-02 | ||
| RPMI1640 | Invitrogen | 11875 | ||
| FBS | Gemini | 100-106 | ||
| Penicillin/Streptomycin | Cellgro | 30-002-CI | ||
| L- glutamine | Invitrogen | 25030081 | ||
| β- mercaptoethanol | Sigma | M7522 | ||
| anti-CD16/32 antibody | Biolegend | 101302 | ||
| Annexin V-FITC Apoptosis Detection Kit | BD Pharmingen | 556547 | ||
| FITC-CD4 | Biolegend | 100406 | ||
| PE-CD8 | Biolegend | 100708 | ||
| anti-c-Erb2/c–Neu | Calbiochem | OP16 | ||
| PE- anti mouse IgG | Biolegend | 405307 | ||
| formaldehyde | Polysciences | 04018 | ||
| Hemocytometer | Hycor | 87144 | ||
| Light microscope | VWR | V200073 | ||
| Mouse IFN-γ ELISA set | BD Pharmingen | 555138 | ||
| Cell culture flasks | Greiner | 658175 |
References
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