貫通電流の一部は、各チャネルの種類に起因するものがある、同時に複数のイオンチャネルを流れる電流磁束を測定するための技術的な障害があり、後に目の肥えた。このニーズに対応するため、このメソッドは、特定の周波数成分を使用して、個々のチャネルタイプのIV曲線を生成する方法を示します。
はじめに:現在、同時に複数のイオンチャネルの種類を測定し、各チャネルの種類に起因する部分に測定された電流を分解するための確立された方法がない。この研究では、インピーダンス分光法は、高度電圧クランプの実験中に測定された定常状態の電流振幅が相関する特定の周波数を識別するために使用できる方法を示しています。方法は、電圧ステッププロトコルに固有の周波数を含むノイズ関数を挿入する伴います。出品作品では、モデル細胞がない、高い相関がなく、イオンチャネルが存在しないときにノイズ関数自体は高い相関を導入していないことも、電圧クランプ回路によって導入されない、とされていることを実証するために使用されます。技術がイオンチャネルを含有する製剤に適用する前にこの検証は必要です。提示プロトコルの目的は、ノイズ関数への単一のイオンチャネル型の周波数応答を特徴づける方法を示すことです。特定の周波数が個々のチャネルのタイプで識別されると、それらは定常状態の電流電圧(IV)曲線を再現するために使用することができます。非常に一つのチャンネルの種類と相関し、最低限、他のチャネルタイプと相関する周波数はして同時に測定された複数チャネルタイプの現在の貢献度を推定するために使用されることがあります。
【方法】電圧クランプの測定は、標準電圧のステップのプロトコール(-150〜+50 mVに、5mVのステップ)を使用して、モデルセルで行った。 1から15 kHzの周波数(ゼロのピーク振幅:50または100mV)の等しい大きさを含むノイズ関数は、各電圧ステップを挿入した。出力信号の高速フーリエ変換(FFT)の実際のコンポーネントは、各ステップの可能性のノイズがある場合とない場合を計算した。電圧ステップの関数として各周波数の大きさは、対応する電圧では電流振幅と相関していた。
結果と結論:ノイズの有無(制御)においては、直流成分を除く全ての周波数の大きさが不十分な相関(| R | <0.5)IVカーブと、DC成分がすべての測定値で0.999よりも大きい相関係数を持っていたのに対し。ノイズ関数は、電圧ステップのプロトコルに追加されたときに、個々の周波数とIV曲線の間に相関関係の質は変化しなかった。同様に、ノイズ関数の振幅を大きくすると、相関を増加させなかった。コントロールの測定値は、それ自体で電圧クランプ回路が0 Hzより上の周波数は非常に定常状態のIV曲線と相関することが発生しないことを示している。同様に、ノイズ関数の存在下での測定は、ノイズ関数は、イオンチャネルが存在しない場合には0 Hzより上の周波数は定常状態のIV曲線と相関することが発生しないことを示している。この検証に基づいて、メソッドは現在、その振幅がそのチャネルの種類と特異的に相関の周波数を識別する目的で、単一のイオンチャネルの種類を含有する製剤に適用することができます。
現在、後で各チャンネルの種類に起因することがどの程度の電流を決定することを意図して同時に複数のイオンチャネルの種類の測定から研究者を防ぐための技術的な障害があります。この制限のため、イオンチャネルは、通常そのような、電圧電流、および活動電位クランプなどの手法を用いて図1は個々のチャネルの種類を調べるために、異種発現系を頻繁に使用されて個別に検討されている2などの心筋細胞などの組織から単離した細胞を操作するとき、他の手段は様々なイオンチャネルをブロックするために使用されている必要があります。例えば、ナトリウムチャネルが遅い脱分極電圧のランプにより失活することができる、3内向き整流カリウムチャネルは、細胞外BaCl2でブロックすることができる、4、カルシウムチャネルは、ベラパミルを使用してブロックすることができます5。
部分的にこの制限を克服する使用される一つの方法は、選択的に適切なエージェントを一つのチャネルタイプをブロックした後、測定を繰り返すと同時に、2つのチャネルタイプを介して現在のフラックスを測定することです。 2つの測定値の減算は、ブロックされたチャネルの種類に、現在の帰属する量を推定するために使用することができます。6しかし、この手法には2つの主要な制限があります。最初に、化学物質を選択的にそれぞれのイオンチャネルをブロックすることができます特定する、、と、いくつかの広く使用されている薬剤は、他の種類のチャネルとの非特異的相互作用を持ってされていない。5,7第二に、それは一つのチャネルが別によって変調されるかどうか、このテクニックから決定することはできないチャンネル。例えば、右心室の高いキール2.1式は伝導速度を押し下げるように、NAV 1.5、キール2.1の異種発現は、モルモットの心室に示されている、そしてそれが相乗関係が2つのチャネル間に存在することが示唆されている。現在8 、これは検証できません。
本研究では、インピーダンス分光法は、同時に測定した複数のイオンチャネルのタイプを研究するための有用なツールであることを示唆している。提示方法が同時に測定された2つのチャネルタイプから電流を識別するために使用されてもいないのに、インピーダンス分光法は、イオンチャネルの機能の他の面の数を研究するために使用されています。グッドマンとアートは、電流クランプのプロトコルが異なる周波数のセルを調整するように変更することができるカメの聴覚有毛細胞を用いて示し、膜電位の振動が内向き整流K +チャネルとCa 2 +チャネルの間の相互作用によるものです。 9漢とFrazier氏はそのインピーダンスは周波数の広い範囲(100 Hzから5 MHzの)上の単一のセルで測定することができます実証、及びK +又はCa 2 +チャネルがブロックされていたがための簡単な手段かもしれないときにインピーダンスの増加が観察さ高スループットの薬物画面でチャンネルのブロックを検出する。10林とフィッシュマンは、内向き整流K +チャネル。11その他のグループが異なる種類のチャネルの電圧クランププロトコルに単一の周波数を挿入しての運動特性を研究するために複雑なコンダクタンスを使用していることを示したこと予想されるいくつかの周波数の応答ではなく、他の人と合意された観測周波数応答。12,13 MillonasとHanckいくつかの周波数が予期される応答は、マルコフモデルで複数の速度定数の存在であることができなかった理由を提案した。このような12件の研究、としてだけでなく、他の人、インピーダンス分光法を使用しながら、イオンチャネルから測定したイオン電流は、理論的な周波数応答と一致していないインスタンスがあることを明らかにした。この研究ではメソッドの目的は、膜の電気回路の基礎的前提の独立した電流振幅との相関の周波数を識別することであるため、これは本研究では問題になりません。 Furtheremoreは、現在の振幅は、それらに挿入されたノイズ関数を持っていない記録の部分から計算されます。他の多くの研究が多数実施し、すべて自分の速度定数と非導通状態を示す多数のイオンチャネルのも現在のモデル。14,15,16 ThompsonらはKCSAチャネルの選択フィルターがNaのための別の結合部位を有することを示した+、Li +(リチウムイオン)、およびK +、および選択性フィルタを介してイオンの動きはチャネルが優先的に細孔を介してK +イオンを行って作るものであるとして1つの結合部位から別のものへ移るの精力的なコスト。17本稿では、範囲を挿入電圧ステップのプロトコルへの周波数(ノイズ関数)のと、その振幅は非常に全体の電流の振幅と相関して周波数を探した。強力な証拠が示唆して提示されているので、複数の速度定数は、差動を介してイオンの伝導の役割を果たすtのチャネルは、これらの速度定数に関連付けられている周波数の導入は、特定の周波数が共振するか非常に特に必要がないという現在の振幅、と相関する可能性があります。本研究で示さ技術は通常、電圧クランプ回路および収集装置をテストするために使用される並列RC回路であるモデルのセルで実行されます。それは、DC以外の任意の周波数が現在の大きさと相関することが期待されていない、とこれは私たちのデータで示されています。我々はまた、ノイズ関数の追加は任意の周波数が高く電流振幅と相関する可能性はなかったことを示している。彼らは、測定機器やノイズ関数は、それ自体で任意の周波数が電流振幅と相関が引き起こされないことを示すため、これら二つの知見は重要である。今後の研究は、イオンチャネルを含む膜を使用して測定を行う場合、それが使用されるチャネルに応じて、多分選択フィルターや細孔の速度定数に対応する周波数は、チャネルの周波数応答に影響を及ぼし、周波数が高い持っている影響を与える、ことが期待される電流振幅を持つか低い相関。
この方法はイオンチャネルを研究するための新しい手法であるため、今後の研究が続くことができる方向の数があります。最初に、技術は特定の絶縁チャンネルの周波数応答を特徴付けるために使用する必要があります。追加の作業はまた、現在の振幅に周波数の振幅を校正するために行われる必要があります。複数のチャネルを個別に特徴づけされると、複数のチャネルタイプを同時に測定する必要があります。技術はまた、活動電位クランプ、電流クランプ、およびフィールドの刺激の研究に使うために改変することができる。これは新しい手法ですが、これまで不可能だった電気生理学的測定を行い、イオンチャネルの生理的役割に貴重な新しい洞察を提供する強力な方法かもしれないかを示しています。
The authors have nothing to disclose.
この作品は、博士Poelzingに授与保健助成金番号R21 – HL094828 – 01の国立研究所によってサポートされていました。
Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
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Matlab | Mathworks | n/a | Natick, MA | |
Clampex 8 | Molecular Devices | Clampex 8 | Sunnyvale, CA | |
Integrating Patch Clamp Amplifier | Molecular Devices | Axopatch 200 | Sunnyvale, CA | |
Headstage | Molecular Devices | CV202 | Sunnyvale, CA | |
16-Bit Data Acquisition System | Molecular Devices | Digidata 1322A | Sunnyvale, CA | |
Model Cell | Molecular Devices | Patch 1 Model Cell | Sunnyvale, CA |