Utiliser l'imagerie Bioluminescent chargé d'enquêter sur une synergie entre Streptococcus pneumoniae Et virus Influenza A de souriceaux

1. Préparation du stock infectieuses de Bioluminescent S. pneumoniae Inoculer un tube de 10ml contenant McCartney bouillon Todd-Hewitt supplémenté avec 0,5% (p / v) d'extrait de levure et un petit morceau de gélose au sang avec bioluminescents S. pneumoniae et grandir statiquement à 37 ° C à la densité optique (600nm) de 0,40 à 0,45. Placer la culture sur de la glace pendant 5 min à l'arrestation des cellules dans cette phase de croissance. Pour les 10 ml de mi-log phase de croissance S. pneumoniae ajouter 1 ml de 80% (v / v) de glycérol et mélanger, aliquot dans les volumes souhaités et stocker à -70 ° C. Déterminer la dose infectieuse de S. bioluminescents Stock pneumoniae par le comte viable de dilutions en série sur gélose au sang. 2. La croissance et la préparation de la grippe A stock de virus La grippe A virus est cultivé dans le liquide allantoïdien de 10 jours oeufs de poule embryonnés. Décongelez un flacon avec le virus grippal A dans les 37 ° C bain-marie. En utilisant une source lumineuse placée sur les sacs aériens (mirage), marque sur la coquille d'oeuf de l'emplacement de la poche d'air à un point exempt de veines sous-jacentes. Désinfecter la surface des œufs en essuyant avec de l'éthanol 70% et essuyer. Percer un petit trou dans le sac d'air juste au-dessus en utilisant la marque scribe de bijoutier. Avec les œufs placés dans un carton avec la couche supérieure de l'air du sac, l'utilisation d'une seringue de 13mm 1ml et une aiguille 26G pour inoculer chaque œuf dans le trou de la coquille avec 0,1 mL de la grippe convenablement diluée d'un virus. Pointez l'aiguille directement vers le bas dans la cavité allantoïdienne, perçant la sacs aériens. Sceller le trou avec de la cire fondue et incuber les oeufs pendant 2 jours dans un incubateur humidifié oeuf à 35 ° C. Après 2 jours d'incubation, les oeufs bougie pour vérifier la présence de vaisseaux sanguins pour confirmer l'embryon est toujours vivant. Si l'œuf est noir à l'intérieur, l'embryon est mort et l'œuf doit être jeté et non utilisés pour la récolte de virus influenza A. Placez les oeufs à 4 ° C pendant la nuit pour tuer les embryons et la constriction des vaisseaux sanguins afin de minimiser les perturbations des navires, que le contact entre le sang et le virus entraînerait dans la liaison du virus aux cellules rouges du sang. Le lendemain, désinfecter la surface des œufs en essuyant avec de l'éthanol à 70%. Travailler dans un cabinet de biosécurité de classe II pour recueillir le liquide allantoïdien contenant le virus influenza A partir des œufs. Enlever la cire et l'utilisation des ciseaux courbes à couper autour du sommet de l'œuf pour enlever le sac d'air au-dessus de la membrane allantoïde. Crevaison et peler la membrane allantoïde aide d'une pince stérile. Aspirer le liquide allantoïdien avec une pipette stérile de 10 ml tout en tenant l'embryon d'un côté avec une autre pipette stérile. Recueillir le liquide allantoïdien regroupés dans 50 mL tubes et de garder sur la glace en tout temps. Si le liquide allantoïdien est sanglante ou jaune contient ne pas ajouter à la piscine. Centrifuger le liquide allantoïdien pour 5min à 2000 rpm à température ambiante pour enlever les débris. Aliquoter le liquide allantoïdien infectieux en 1-2 cryotubes ml et conserver à -70 ° C. Déterminer la grippe A titre viral du liquide allantoïdien décongelés en 3 dosages effectués de façon indépendante la plaque formant dans Madin-Darby cellules rénales canines (voir ci-dessous). Utiliser un aliquote de nouveaux virus pour chaque expérience. Répétés de gel-dégel réduiront le titre infectant. 3. Infection intranasale de souris avec S. bioluminescents pneumoniae et / ou le virus grippal A Décongeler des stocks bioluminescents S. pneumoniae et diluer à dose souhaitée dans le PBS. Doucement ramasser cinq jours des souris âgées entre l'index et le pouce et tenir debout. Utiliser une pipette pour déposer bioluminescents S. pneumoniae sur narines dans un volume de 3μl. Attendez jusqu'à ce que tous les de l'inoculum est inhalée avant de placer la souris de retour dans la cage. Utilisez 3μl de PBS pour une infection simulée. Trois à neuf jours après la colonisation avec bioluminescents S. pneumoniae, le dégel d'une partie aliquote de liquide allantoïdien contenant le virus grippal A et diluer dans du PBS à la concentration voulue. Infecter des souris avec le virus grippal A dans un volume de PBS 3μl tel que décrit à l'étape 3.2. Utilisez 3μl de liquide allantoïdien dilué des œufs non infectés par le virus de l'infection maquette. Surveiller le bien-être des souris quotidienne en observant leur apparence, le comportement, l'état corporel et, chez les souris qui sont ≤ 3 jours, la présence de taches de lait. Un guide pour les points d'extrémité sans cruauté et les critères d'intervention doit être élaboré en consultation avec le vétérinaire des animaux de laboratoire (tableau 3). 4. Bioluminescent imagerie utilisant le spectre IVIS (Caliper Life Sciences) Préparer un mélange de kétamine à 0,75 mg / ml et de xylazine 1.76mg/ml dans l'eau injectable. Pour anesthésier les souris, injecter 100μl/10 g de poids corporel en péritonéalecavité. Placez la souris anesthésiées dans la boîte d'imagerie. Une attention particulière devrait être accordée au maintien de la région anatomique d'intérêt parallèlement à la caméra lors de la passation de l'intérieur de la souris sur la case d'imagerie / chambre. Billetterie de la Place des souris dans IVIS et permettre l'entrée dans la boîte de l'isoflurane à 0,5 L / min pour maintenir l'anesthésie. Régler la machine IVIS de corriger la plate-forme d'imagerie et de binning et la capture d'image pendant 7 minutes. Autoriser les souris pour récupérer de l'anesthésie dans une boîte réchauffée (par exemple en utilisant un tampon de chaleur) avant de revenir à la cage à la maison. Les images sont analysées et ajustées à la même échelle en utilisant les logiciels d'image habitable version du paquet 3.0 (Caliper Life Sciences). Signaux bioluminescents dans une région sélectionnée d'intérêt peut être quantifié comme étant le flux total (photons / s) ou le rayonnement moyenne (photons / s / cm 2 / sr). 5. Traitement des tissus afin de déterminer la charge bactérienne et titre du virus Les souris sont euthanasiés par le CO 2 asphyxie et la fourrure désinfecté à l'aide d'éthanol à 70%. Immobiliser l'animal sur une planche à découper dur. En utilisant une lame scalpel stérile, coupé par le milieu de la tête de l'animal, en commençant postérieure, et exposer le nasopharynx par le pliage de chaque côté de l'extérieur la tête. Recueillir le tissu nasopharyngé de chaque animal en grattant le tissu de chaque moitié de la tête à l'aide des pinces stériles et placer dans 1.5ml glacée RPMI. Restez sur la glace. Ouvrez la cage thoracique à l'aide des ciseaux et enlever les poumons à l'aide des pinces stériles et des ciseaux. Rincez les poumons à trois reprises dans du PBS pour enlever toute trace de sang et de rassembler dans 1.5ml glacée RPMI. Restez sur la glace. Utilisez un homogénéisateur pour homogénéiser les tissus, placer dos à la glace. Supprimer une partie aliquote du tissu homogénéisé et l'utiliser pour déterminer la charge bactérienne. Préparer des dilutions en série de l'homogénat de tissu et de la plaque sur le HBA. Les plaques de culture à 37 ° C pendant 18-24 heures et déterminer le nombre viable. Les titres des bactéries dans un organe particulier peut alors être corrélées avec le nombre de photons observés dans cette région. Centrifuger le reste du tissu homogénéisé à 3500 rpm pendant 10 min à 4 ° C. Recueillir le surnageant et le transfert à nettoyer, des tubes stériles. Magasin de surnageant à -70 ° C et déterminer le titre viral par dosage de plaque. 6. Plaque d'essai pour déterminer la grippe A titre de virus dans des homogénats de tissu Les titres infectieux du virus sont déterminés par la formation de plaques sur des monocouches confluentes de rein de chien Madin-Darby (MDCK). Cellules MDCK sont cultivées en routine dans RF10 (tableau 1) dans des bouteilles en culture de tissus (Nunc) et passages où confluent. Détachez les cellules MDCK à partir de bouteilles de culture tissulaire en utilisant la trypsine. Laver les cellules dans RF10 et de recueillir les cellules par centrifugation à 1200 rpm pendant 5 min. Jeter le surnageant et remettre le culot cellulaire dans le RF10. Compter les cellules MDCK en utilisant un hémocytomètre et colorant vital. Graine de chaque puits de 35 mm des plaques 6 puits (Nunc) avec 1.2×10 6 cellules MDCK en 3ml RF10 et la culture des cellules à 37 ° C et 5% de CO 2 pour atteindre une confluence (dans ~ 24 heures). Préparer Leibovitz dsL15 médias et de 1,8% (p / v) agarose superposition des médias (tableau 1). Aliquoter dsL15 médias et de 1,8% (p / v) agarose dans 50 ml dans des flacons stériles. Gardez dsL15 média à 4 ° C jusqu'à leur utilisation et d'agarose à 56 ° C jusqu'à utilisation. Vérifiez que les monocouches de cellules MDCK sont confluentes et laver les cellules avec du RPMI + par l'aspiration du RF10 et son remplacement par ~ 1,5 ml de RPMI +. A aucun stade de la procédure devrait être autorisé les plaques de complètement sécher. Incuber les plaques à 37 ° C jusqu'au moment d'ajouter les échantillons contenant le virus. Préparer des dilutions en série des échantillons de virus dans RPMI +. Conserver les échantillons sur la glace jusqu'à utilisation. Aspirer RPMI + à partir des monocouches et ajouter 135uL RPMI + des dilutions appropriées de l'échantillon de virus à chaque puits. Testez chaque échantillon en double. Incuber les cellules MDCK avec les échantillons de virus pendant 45 min à 37 ° C et CO 2 5%. Secouez délicatement les plaques toutes les 15 minutes pour distribuer le virus de manière uniforme et prévenir l'assèchement des monocouches de cellules MDCK. Déplacer l'agarose à partir de 56 ° C à 46 ° C bain-marie chaud et dsL15 médias à 46 ° C en bain-marie. Après une incubation de 45min du virus sur les monocouches MDCK, prenez des plaques de 5% de CO 2 incubateur. Retirer agarose et L15 des médias de 46 ° C bain-marie. Ajouter 0,2 ml de trypsine de 0,1% à 50 mL d'dsL15 médias, que d'ajouter 50 ml de trypsine pour dsL15 + 50mL de 1,8% (p / v) agarose. Mélanger l'agarose et L15 doucement et ajouter 3ml de milieu de recouvrement dans chaque puits des plaques de 6 puits. Remuer doucement pour assurer la monocouche de cellules MDCK entière est couverte. Une fois que la superposition est mis incuber les plaques à 37 ° C et 5% de CO 2 pendant 2-4 jours. A la fin de la période d'incubation, compter le nombre de plaques comme une mesure de virus infectiviTy. Si nécessaire, les plaques peuvent être visualisés par coloration des monocouches avec du cristal violet dissous dans du méthanol. 7. Section C – Secrets de la réussite: 1 Tous les travaux expérimentaux avec S. pneumoniae (inoculation par exemple des cultures en milieu liquide, le traitement de tissus provenant de souris infectées par S. pneumoniae) est effectuée dans un cabinet de biosécurité de classe II. 1.1 Nous créons bioluminescents S. pneumoniae en introduisant plasmide pPJTG28 3. Cependant, une grande variété de différents bioluminescents S. pneumoniae sont disponibles 4-6. Bioluminescent S. pneumoniae peuvent également être achetés auprès de Caliper Life Sciences Inc (MA, USA). 1,1 cinétique de croissance des diverses S. pneumoniae peuvent différer et doit être déterminé pour chaque souche. Cela peut prendre entre 3 à 4 heures pour atteindre OD600nm = 0,4 à 0,45. 1.4 Nous s'attendrait normalement les stocks infectieuses pour atteindre la concentration des 10e8 UFC / ml et de recommander une dilution allant de 10e à 10e-4-8 pour déterminer la concentration de bactéries viables. 2.6 Le titre approprié à utiliser pour inoculer les oeufs, dépend de la souche virale utilisée et peut varier de 3 à 10E-10E-5. Grippe A souches de virus obtenus à partir de surnageants de culture de tissus peut parfois être utilisé pur. Nous utilisons régulièrement 3.2a 2000 UFC de S. pneumoniae souche EF3030 pour coloniser 5 jours des souris âgées 3. La dose précise infectieux de l'inoculum est déterminé rétrospectivement pour chaque expérience en étalant des dilutions en série de l'inoculum sur les plaques d'agar au sang de cheval. La capacité de la S. pneumoniae souche de coloniser les souris est d'abord déterminé par comptage des homogénats de tissus viables (ex. nasopharynx, poumons) à différents moments après l'inoculation des souris. 3.2b Il n'est pas nécessaire d'utiliser Anesthésie pour administrer les bactéries ou les virus aux animaux par inhalation. Souriceaux (ainsi que chez la souris adulte) devrait être freinée par la main et tient debout par l'enquêteur, l'inoculum (3 microlitre pour les souriceaux, jusqu'à 10 microlitre pour les souris adultes) est ensuite déposé sur les narines et par inhalation ensemble de l'inoculum est confirmé par l'observation. 3.2c Retirer les souris néonatales, un par un à partir du nid et ensemencer avec des bactéries ou des virus comme nécessaire. Marquer la queue de l'animal à l'aide d'un marqueur permanent si l'animal est nécessaire et revenir à la cage immédiatement. Frottez les animaux avec certains matériaux de litière pour que le barrage va accepter les chiots de retour dans le nid. Remarque: marqueur permanent déteint les animaux rapidement et doit être ré-appliquée quotidiennement. Alternativement, un système de tatouage peut être utilisé pour identifier chaque animal. 3.3 Nous utilisons 20 PFU le virus grippal A (H3N2) Udorn/307/72 à infecter des souris de 8 à 14 jours anciens 3. La mortalité et la morbidité observée chez les animaux dépendra de la souche de S. pneumoniae et le virus grippal A utilisé. Le tableau 3 présente un ensemble utile de points d'extrémité sans cruauté et les critères d'intervention à utiliser chez des souris de moins de 21 jours d'âge. En général, nous ne constatons aucune mortalité ou de morbidité en utilisant S. pneumoniae EF3030 et la grippe A souche du virus Udorn/307/72 (H3N2) lorsque les souris sont> 10 jours. 4.2 Pour être précis, les souris peuvent être pesés avant l'injection de la solution anesthésique. A titre indicatif, environ 50-75 microlitres de solution anesthésique est utilisé pour 20 jours des souris âgées. La souris est entièrement anesthésié quand ne pas répondre à une pincée dans la queue ou des membres postérieurs. Alors que dans le IVIS, les souris seront également exposées à l'isoflurane qui va ajouter une anesthésie. Le timing de l'imagerie après l'infection des souris dépend de la souche (s) de S. pneumoniae et le virus grippal A utilisé ainsi que sur les symptômes de l'intérêt. Effectuer quelques expériences pilotes afin d'optimiser le calendrier de l'imagerie de bioluminescence peut être nécessaire. 4.3 Les souris peuvent être soit placés dans une boîte d'isolation (qui empêche les contaminants de pénétrer ou de quitter la boîte) ou, alternativement, peuvent être placés directement dans l'appareil d'imagerie. Nous utilisons la boîte d'isolement pour les expériences avec des souris infantile, afin d'assurer la souris reste anesthésiée pendant la procédure d'imagerie et de prévenir la contamination de l'IVIS avec S. pneumoniae et / ou le virus grippal A. 4.3 Utiliser une image ventrale de la souris pour obtenir une image des voies respiratoires. Une image latérale de la souris donne une image plus sensible de l'oreille. 4.4 Lorsque les souris sont placées directement dans la chambre, l'isoflurane est livré à la souris via cônes avant. Pour les expériences dans lesquelles souriceaux sont utilisés, la boîte d'isolation est préférée car les cônes du nez ne tiennent pas sur souriceaux. 4,5 Til temps d'exposition total nécessaire pour capturer une image peut varier entre les expériences selon la force du signal bioluminescent, l'emplacement du signal, souche bactérienne et la souche de souris utilisée. Sur ce dernier point, les deux pigments et de la fourrure peut considérablement atténuer le signal détectable au total. La caméra sur le spectre IVIS est un arrière-aminci, rétroéclairé CCD offrant une large gamme dynamique (65 536 niveaux de gris). Idéalement, le temps d'exposition doit être configuré pour capturer entre 60 et 60 000 chefs d'accusation. Dans notre expérience avec souris C57BL / 6, l'augmentation du temps d'imagerie au-delà des 7 minutes ne nettement améliorer le rapport signal sur bruit. D'autres options pour augmenter le signal de bioluminescence comprennent l'augmentation du degré de binning (ie. à grande) et en utilisant un petit champ de vision. Surtout, la quantification ne doit pas être effectuée sur les zones à l'intérieur de l'image contenant des pixels saturés, car cela donne une valeur sous-estimée pour le nombre de photons détectés. En cas de doute quant aux conditions optimales, la fonction d'auto-exposition peut être utilisé comme ligne directrice. 4.5 Si un signal fort bioluminescentes dans une partie de la souris fait obstruction à la détection de la bioluminescence dans une région voisine, certaines régions de la souris peut être recouvert de papier noir et d'imagerie peut procéder comme d'habitude 4.7 Si le signal luminescent est quantifié en photons (par opposition aux chefs) des variations dans les conditions d'imagerie (imagerie en temps, par exemple) entre les expériences n'affectera pas la mesure du signal de bioluminescence. 4.8 Si vous utilisez le flux total de mesurer les photons dans une région déterminée, en sorte que la même «région d'intérêt» forme est utilisé pour tous les échantillons. Souris 5.1a peut être euthanasié à tout point de temps après l'infection par le virus grippal A, selon l'intérêt du chercheur. Nous déterminent habituellement titre bactériennes et virales à 6 jours après l'infection par le virus grippal A (H3N2) Udorn/307/72 et ne respectent pas toute morbidité / mortalité. Cependant, la morbidité et la mortalité observée dans ces expériences varie en fonction de la grippe A et S. pneumoniae souche virale utilisée et le point de temps chosed devrait prendre la mortalité et de morbidité en compte pour minimiser l'impact sur le bien-être animal. Le tableau 3 fournit un guide utile pour les critères d'intervention et les paramètres pour une utilisation humaine dans ces expériences. Généralement, les souris sont euthanasiées et des tissus traités comme décrit dans les 3 heures après l'imagerie in vivo bioluminescentes. 5.1b Souris de moins de 10 jours sont résistants à l'hypoxie et sont euthanasiés par décapitation. Dans la configuration décrite expérimental, les souris sont au moins 14 jours et peut être euthanasiés par le CO 2 asphyxie. 5.7 Sang-agar peut être complété par la gentamicine 5μg/ml pour prévenir la croissance des bactéries commensales dans des homogénats de tissus nasaux. La gamme de dilutions utilisées dépendront de la S. pneumoniae souche utilisée. Pour les expériences dans 20 jours des souris âgées avec S. pneumoniae souche EF3030, nous utilisons soignée, 10e-1, 10e et 10e-2-3. 5,8 stocker chaque échantillon de tissu homogénéisé dans au moins deux aliquotes, de sorte qu'un échantillon de sauvegarde est disponible au cas où le virus de l'essai de plaque échoue! Un titre précis virale ne peut être obtenue à partir d'un échantillon décongelé fois après congélation, mais pas à partir d'échantillons à plusieurs reprises le gel dégelé. 6.1 Lorsqu'il est cultivé confluentes 90-100%, un seul 150cm 2 flacon de culture tissulaire donnera suffisamment de cellules MDCK pendant cinq plaques 6 puits. 6.5 La dilution optimale de série dépendra de la souche virale utilisée et le temps après l'infection. Typiquement, nous devrions utiliser soignée, 10e et 10e-1-2 dilutions pour orgue homogénats prise 6 jours après l'infection par le virus grippal A. 6.6 Utilisation des dilutions en série de stock de virus est un témoin positive appropriée pour une utilisation dans chaque essai de plaque. Comme témoin négatif, RPMI + peut être utilisé. 8. Les résultats représentatifs: Figure 1. Schéma de principe d'oeuf de poule embryonnés. Figure 2. BLI de S. pneumoniae infection de la souris sur le jour 3 et 4 jours après l'infection par le virus de la grippe se moquer. Figure 3. BLI de S. le virus de la grippe pneumoniae et co-infectés par la souris le jour 3 et 4 jours après l'infection par le virus de la grippe. Figure 4. Charge bactérienne dans le nez d'un simple et un co-infectionTed souris. Figure 5. Titres viraux dans le nez et les poumons de souris co-infectées. Médias Contenu 1,8% (p / v) Agarose Ajouter 0,9 gramme d'agarose pour 50mL distillée H 2 O, stériliser à l'autoclave à 121 ° C pendant 10min. Transfert à 56 ° C bain marie pour refroidir. Double force Leibovitz L15 moyenne (DS L15) 1 sacoche de L15 en poudre (pour rattraper 1L) est dissous dans 450 ml distillée stérile H 2 O et agite jusqu'à dissolution. Le pH est ajusté à pH 6,8 avec HCl 1M. Puis compléter avec 4 ml de 7% (p / v) de NaHCO3, 0,4 ml d'HEPES (0,5 M, pH 6,8), 200 U / ml de pénicilline, 200 pg / ml de streptomycine, 60 pg / ml de gentamicine. Ajuster le volume final à 500 ml et stériliser par filtration. Gélose au sang de cheval (HBA) 4% (Oxoid, Basingstoke, au Royaume-Uni) HBA, dH 2 O, 7% (v / v) Sang de cheval RF10 RPMI-1640 contenant 2 mM de glutamine, du pyruvate de sodium 2nm, 24 pg / ml de gentamicine, 100 U / ml de pénicilline, 100 pg / ml de streptomycine, 10% (v / v) inactivé à la chaleur sérum de veau foetal. RPMI + RPMI-1640 contenant 2 mM de glutamine, du pyruvate de sodium 2nm, 24 pg / ml de gentamicine, 100 U / ml de pénicilline, 100 pg / ml de streptomycine Bouillon Todd-Hewitt + extrait de levure 0,5% Todd Hewitt Broth (Oxoid, Basingstoke, au Royaume-Uni) en DH 2 O additionné de 2% (p / v) d'extrait de levure Tableau 1. Médias spécifiques utilisés dans ce protocole. Nom du produit Tapez Société Numéro de catalogue Commentaire Milieu RPMI 1640 Réactifs Gibco 21870-076 Trypsine Réactifs Worthington Biochemical Corporation LS003740 TPCK traités Leibovitz milieu L-15 Réactifs Gibco 41300-039 Agarose, je tape Réactifs Sigma-Aldrich A6013 Utilisez faible température de fusion d'agarose, comme SeaPlaque agarose Madin-Darby Canine Kidney cellules Réactifs ATCC CCL-34 Tableau 2 réactifs et équipements spécifiques.: Effet sur la protection des animaux Légère à modérée signes une B sévère signes Non spécifiques signe (s): Apparence Légère à modérée horripilation sans déshydratation (tentes de peau) Horripilation, une déshydratation (tentes de peau) État corporel gain de poids réduits Pas de gain de poids ou la réduction du poids Comportement Discrète mais sensible, diminué d'interaction avec leurs pairs. Insensible à l'activité et la provocation. Isolé de la même portée d'autres Des conditions particulières ou anormale signe clinique (s): Absence de tache de lait (<2-3 jours) Essayez d'encourager tétée si cela a été observé pour <24h. Si aucune preuve de la tache de lait, même avec les encouragements après 24-48h, ou si a évidemment pas allaité, envisager l'euthanasie. D'autres signes Cherchez l'animalerie Gestionnaire / animaux de laboratoire vétérinaire conseil re: action appropriée ou euthanasier si l'animal est dans la douleur modérée ou sévère ou de détresse Tableau 3. Critères d'intervention pour les souriceaux (<21 jours): une fois un ou plusieurs «légère à modérée" signes sont observés augmenter la fréquence des observations à deux fois par jour et de demander conseil à l'agent de protection des animaux, le cas échéant afin que les traitements et les soins peuvent être donnés. b Quand un ou plusieurs «sévère» signes sont observés, euthanasier les souris à l'aideméthode appropriée. Souris <10 jours sont euthanasiés par décapitation, souris> 10 jours sont euthanasiés par asphyxie CO 2.