옥내 핵산 - 수정 Oligonucleotides에 의해 Transfection 및 모기 세포 대상 유전자의 돌연변이 유발
Summary
Oligonucleotides은 특히 모두 transfected 대상 유전자의 단일 염기 대체 사이트로 사용할 수 있습니다<em> 아노 펠 레스 gambiae</em>과<em> 아노 펠 레스 stephensi</em> 세포.
Abstract
Plasmodium의 기생충, 말라리아의 원인이되는 대리인은 만 250 새로운 감염이 매년 발생하는 감염 아노 펠 레스 모기의 물린 통해 전송됩니다. 연구의 수십에도 불구하고, 말라리아에 대한 백신도 새로운 제어 전략의 필요성을 강조 아직 없습니다. 한 혁신적인 접근은 효과적으로 말라리아 기생충 전송을 제어하는 유전자 조작 모기를 사용하는 것입니다. 대상 돌연변이 유발을 통해 모기의 세포 신호 전달 경로의 고의적인 변경은, 기생충 개발 1 조절 발견되었습니다. 이러한 연구에서, 우리는 변화를위한 잠재적인 유전자 목표를 식별하기 시작할 수 있습니다. 타겟 돌연변이 유발은 전통적으로 대상 유전자와 대형 DNA 분자 사이의 동종 재조합에 의존하고 있습니다. 그러나, 안정적으로 변형 세포 라인의 생성 등 복잡한 DNA 분자의 건설 및 사용은 비용, 시간 소요 종종 비효율적이다. 따라서, 고정 핵산 – 수정 oligonucleotides (LNA 기능)을 사용하여 전략 episomal 및 염색체 DNA의 유전자 타겟 (2 검토)에 인공 단일 염기 대체를 소개하는 유용한 대안을 제공합니다. LNA – ON – 중재 대상으로 돌연변이 유발은 효모와 생쥐 3,4 모두 교양 세포에 대한 관심의 유전자에 변이 점을 소개하기 위해 사용되었습니다. 우리는 LNA 기능이 아노 펠 레스 gambiae과 아노 펠 레스 stephensi 세포 모두에서 녹색 형광 단백질 (GFP) 표현에 파란색 형광 단백질 (BFP) 표현에서 스위치로 이어지는 transfected episomal 대상에서 하나의 염기 변화를 소개하는 데 사용할 수있는 것을 여기에 표시 . 이 변환은 모기 세포 대상 유전자의 돌연변이 유발 효과가 LNA 기능에 의해 중재이 기술은 체외에서 생체내의 염색체 돌연변이 유발 타겟에 적용 될 수있는 제안이 될 수 있다고 처음으로 보여줍니다.
Protocol
Discussion
여기 A.로 LNA 기능의 transfection 다음 episomal 유전자 대상에서 단일 염기의 목표 전환에 대한 체외 방법 및 증거를 제공 stephensi 및 A. gambiae 세포. LNA – ON – 중재 유전자 변환은 사이트 특정 DNA 수리 대응의 유도가 필요합니다, 우리의 데이터는 모기 세포가 특정 사이트 돌연변이 유발이 메커니즘을 지원할 수 있음을 나타냅니다. 방법 여기서 제시가 episomal 대상의 변환…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 유동세포계측법 그녀 도움 캘리포니아 국립 메이트 연구 센터에서 애비 스피너 감사하고 싶습니다. 이 연구는 국립 알레르기 및 전염병 연구소 (NIAID) 보건 국립 연구소 (NIH) AI073745, AI080799 및 AI078183의 기금에 의해 지원되었다.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Effectene transfection reagent | Qiagen | 301425 | ||
| GFP control plasmid (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-neg) | Invitrogen | K4935-00 | ||
| BFP plasmid (pcDNA5/FRT/TO) | Gift from Dr. Concordet3 | |||
| LNA-ONs | Gift from Dr. Concordet3 | |||
| MEM, Earle’s w/ glutamine | Invitrogen | 11095 | ||
| Fetal calf serum (FCS) | Invitrogen | 16000 | ||
| Schneider’s Drosophila medium | Invitrogen | 11730 | ||
| Non-essential amino acids | Invitrogen | 11140 | ||
| 10% D-glucose | Sigma | G5767 | ||
| Penicillin-streptomycin antibiotic | Invitrogen | 15140 | ||
| 6-well culture plates | Corning | 3516 |
References
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