ترنسفكأيشن والطفرات في الجينات المستهدفة في الخلايا عن طريق البعوض مغلق [أليغنوكليوتيد] حمض تعديل الأحماض النووية
Summary
ويمكن استخدام [أليغنوكليوتيد] إلى موقع بديل على وجه التحديد النوكليوتيدات واحد من الجينات المستهدفة في كل من transfected<em> الأنوفيلة الغامبية</em> و<em> الأنوفيلة stephensi</em> الخلايا.
Abstract
وتنتقل الطفيليات المتصورة ، العامل المسبب للمرض الملاريا ، عن طريق لدغات البعوض المصابة الأنوفيلة الناتجة في أكثر من 250 مليون إصابة جديدة سنويا. رغم عقود من البحث ، وأنه لا يوجد لقاح ضد الملاريا ، وتسليط الضوء على الحاجة إلى استراتيجيات مكافحة الرواية. نهج واحد هو استخدام مبتكرة من البعوض المعدل وراثيا لمكافحة الملاريا بفعالية انتقال الطفيلي. تم العثور على التعديلات المتعمدة من مسارات إشارات الخلية في البعوض عن طريق الطفرات المستهدفة ، لتنظيم الطفيلي التنمية 1. من هذه الدراسات ، ويمكننا أن نبدأ في تحديد الأهداف المحتملة للتحول الجينات. وقد اعتمد الطفرات المستهدفة تقليديا على إعادة التركيب مثلي بين الجينات المستهدفة وجزيء DNA كبيرة. ومع ذلك ، وبناء واستخدام مثل هذه جزيئات الحمض النووي لتوليد معقدة من خطوط الخلايا تحولت ستابلي غير مكلفة ، وتستغرق وقتا طويلا وغير فعالة في كثير من الأحيان. ولذلك ، ووضع استراتيجية استخدام حمض النووي مؤمن المعدلة [أليغنوكليوتيد] (LNA فيرفكس) يوفر بديلا مفيدا لإدخال بدائل اصطناعية النوكليوتيدات واحد في episomal والكروموسومات الجينات أهداف الحمض النووي (التي استعرضت في 2). وقد استخدمت LNA – ON بوساطة الطفرات التي تستهدف إدخال طفرات الجينات في نقطة من الفائدة في خلايا الخميرة المثقف على حد سواء والفئران 3،4. نعرض هنا التي يمكن استخدامها LNA الإضافات إلى إدخال تغيير واحد في النوكليوتيدات استهداف episomal transfected أن النتائج في التحول من اللون الأزرق الفلورسنت التعبير (BFP) البروتينات الفلورية الخضراء إلى التعبير (GFP) البروتين في الأنوفيلة الغامبية على حد سواء والخلايا الأنوفيلة stephensi . يوضح هذا التحويل للمرة الأولى التي يمكن أن تكون الطفرات بوساطة فعالة من الجينات المستهدفة في الخلايا بواسطة البعوض LNA الإضافات ويشير إلى أن هذه التقنية يمكن أن تنطبق على الطفرات الكروموسومية من الأهداف في المختبر والمجراة.
Protocol
Discussion
نحن هنا في طريقة تقديم الأدلة والمختبر لتحويل المستهدفة من النوكليوتيدات واحد في الهدف الجين episomal التالية ترنسفكأيشن من LNA الإضافات إلى A. وألف stephensi خلايا الغامبية. LNA – ON بوساطة التحويل الجيني يتطلب استحثاث موقع محدد الحمض النووي ردا الإصلاح ؛ الب…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نود أن نشكر آبي سبينر في المركز الوطني للبحوث الرئيسيات في كاليفورنيا للحصول على المساعدة لها مع التدفق الخلوي. وأيد هذه الدراسة بتمويل من المعهد الوطني لأمراض الحساسية والأمراض المعدية التابع لمعاهد الصحة الوطنية (NIH) AI073745 ، AI080799 وAI078183.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Effectene transfection reagent | Qiagen | 301425 | ||
| GFP control plasmid (pcDNA6.2-GW/EmGFP-miR-neg) | Invitrogen | K4935-00 | ||
| BFP plasmid (pcDNA5/FRT/TO) | Gift from Dr. Concordet3 | |||
| LNA-ONs | Gift from Dr. Concordet3 | |||
| MEM, Earle’s w/ glutamine | Invitrogen | 11095 | ||
| Fetal calf serum (FCS) | Invitrogen | 16000 | ||
| Schneider’s Drosophila medium | Invitrogen | 11730 | ||
| Non-essential amino acids | Invitrogen | 11140 | ||
| 10% D-glucose | Sigma | G5767 | ||
| Penicillin-streptomycin antibiotic | Invitrogen | 15140 | ||
| 6-well culture plates | Corning | 3516 |
References
- Corby-Harris, V. D. A., Watkins de Jong, L., Pakpour, N., Antonova, Y., Ziegler, R., Ramberg, F., Lewis, E. E., Brown, J. M., Luckhart, S. L., Riehle, M. A. A novel strategy for controlling malaria transmission in the mosquito Anopheles stephensi. PLOS Pathogens. , (2010).
- Braasch, D. A., Corey, D. R. Locked nucleic acid (LNA): fine-tuning the recognition of DNA and RNA. Chem Biol. 8, 1-7 (2001).
- Andrieu-Soler, C. Stable transmission of targeted gene modification using single-stranded oligonucleotides with flanking LNAs. Nucleic Acids Res. 33, 3733-3742 (2005).
- Parekh-Olmedo, H., Drury, M., Kmiec, E. B. Targeted nucleotide exchange in Saccharomyces cerevisiae directed by short oligonucleotides containing locked nucleic acids. Chem Biol. 9, 1073-1084 (2002).
- Rhee, W. J., Santangelo, P. J., Jo, H., Bao, G. Target accessibility and signal specificity in live-cell detection of BMP-4 mRNA using molecular beacons. Nucleic Acids Res. 36, e30-e30 (2008).
- Marras, S. A., Kramer, F. R., Tyagi, S. Genotyping SNPs with molecular beacons. Methods Mol Biol. 212, 111-128 (2003).
- Tyagi, S., Bratu, D. P., Kramer, F. R. Multicolor molecular beacons for allele discrimination. Nat Biotechnol. 16, 49-53 (1998).
- Blandin, S. A. Dissecting the genetic basis of resistance to malaria parasites in Anopheles gambiae. Science. 326, 147-150 (2009).
- Niare, O. Genetic loci affecting resistance to human malaria parasites in a West African mosquito vector population. Science. 298, 213-216 (2002).
- Riehle, M. M. Natural malaria infection in Anopheles gambiae is regulated by a single genomic control region. Science. 312, 577-579 (2006).
