Парные Patch Clamp Recordings от Мотор-нейрон и целевые скелетных мышц в данио рерио

1. Подготовка рыбы для парных Recordings Перед началом процедуры, подготовить пять ключевых решений, которые включают в себя: Ванна Решение, Ванная Решение с Tricaine (MS222), Ванная Решение формамидом, Нейрон внутреннее решение и мышцы внутренних решений. Затем собираем один личиночной данио в возрасте от 72 до 96 часов и место в ванной Решение с Tricaine. В течение одной минуты воздействия анестетика, рыба не будет реагировать на прикосновения. Место рыб в верхней части пластиковой блюдо и с помощью стереомикроскопа, обезглавить с двойным лезвием края. Передача рыбу камеры записи стекла покрыты sylgard и наполнен ванны решение. Закрепить на каждом конце, вставив электролитически заостренными контакты вольфрама через хорды. Создать кожный лоскут возле ростральной конце рыбу с вывод, который будет обеспечивать адекватный контроль за пару тонких щипцов. Удалить вышележащих кожу, удерживая ее вблизи ростральной булавку с парой тонких щипцов. Пил медленно в каудальном направлении, чтобы удалить кожу. Лечить рыбу с 3 мл ванны Решение формамидом в течение 3-5 минут, чтобы блокировать мышечные сокращения, которые могут помешать записи. Промыть 5 раз с нормальной Решение Бат. Удалите часть поверхностного слоя мышц в течение от 5 до 6 сегментов, осторожно слом со стороной вольфрама булавкой. Передача рыбу прямой микроскоп расположен в клетку Фарадея, чтобы оградить электрических помех. Микроскоп оснащен фиксированным этапе, большим рабочим расстоянием 40x объективных и зум 0,5 до 4 раз. Микроскоп установлен на этапе трансляции моторизованных XY для того, чтобы двигаться подготовки между нервной и мышечной при высокой мощности. Использование дифференциального интерференционного контраста оптика помогает визуализировать нейронов. Меньше 0,5 зум х, использовании широкого отверстия 15-микронной пипетки для удаления покрывающей мышцы и подвергать спинного мозга. Отрицательное давление подается через 3 см одноразовый шприц и мышечные клетки удаляются один за другим. Эта процедура повторяется в течение 5 до 6 сегментов спинного скелетных мышц. Же широкий отверстие пипетки используется также удалить два верхних слоях мышц брюшного получить целевой быстро скелетных мышцах. Это завершает подготовку для парных записей и микроскоп зума увеличена до примерно 1,6. 2. Парные Записи CaP Мотор-нейронов и клеток-мишеней мышц Очищается сегменты будут отсканированы, чтобы найти CaP нейронов. Каждый геми-сегмент спинного мозга содержит один большой, диаметром 10 микрон, CAP моторный нейрон. Это слеза формы сома расположена поверхностно под оболочки спинного возле хвостового конца наиболее сегментарные границы. Нейрона CaP выбран для записи и вентральных мышц цели в соседних хвостовой сегмент сканируется для проверки целостности. Два электрода расположены патч для записи, одна для нейронов и второй для мышц. Верхнего электрода имеет мелкий конус для проникновения жесткой оболочки спинного и наконечник открытия около 2 мкм. Нижний электрод имеет более крутой конусом для низкого сопротивления напряжения зажим записи скелетных мышц Позиция нейрона электрод под углом примерно 30 градусов, чтобы проникнуть спинного оболочки, около половины сегмента ростральнее выбранного нейрона CAP. Advance электрода использованием осевой манипулятор диск при применении нежной постоянным положительным давлением около 60 миллиметров ртутного. Как электрода прорывается оболочки, CaP нейрона может быть, перемещенных в результате перфузии от электрода, требующие корректировки фокуса. Когда электрод касается РПЖ нейрона Сома положительное давление будет снято и обычно приводит к немедленному образованию уплотнения gigaohm. Однако в некоторых случаях, когда печать не в форме, становится необходимым применять нежные отрицательным давлением. После уплотнения образования, потенциал электрода регулируется до 80 мВ и применения отрицательного давления разрывает клеточную мембрану. Нейрона РПЖ характеризуется входным сопротивлением 140 до 180 мега-Ом и потенциала действия, что выбросы +40 милливольт. Это проверяется путем введения возрастающих деполяризующего шаги в соответствии с действующим зажим до потенциала действия вызвали. Далее, микроскоп переехал в вентральной мышцы с использованием переводчик XY моторизованных при высокой мощности. Быстро мышечных клеток выбирается из целевой области. Мышцы электрод подошел к ячейке целевой мышцы под положительным давлением, которое при попадании, формы gigaohm печатью. Электродный потенциал корректируется до -50 милливольт для инактивации натриевых каналов и при легком сосать клеточная мембрана лопнула. Падение сопротивления от 100 до 200 мега-Ом и внезапное появление большого емкостного вступления переходных сигналов. Для проверкидля парных записи, мотор-нейрон деполяризованного путем постепенного больше инъекции тока, пока потенциала действия вызвали. На данный момент концевой пластинки ток должен быть вызван в мышцах. Продолжение стимуляции motorneuron на 1 герц приводит к концевой пластинки токов без сбоев. Как стимул частота увеличивается до 100 Гц концевой пластинки токов колебаться в амплитуде и пройти функциональное истощение в течение 10 секунд стимуляции. 3. Представитель Результаты Как правило, запись нейронной стабилен в течение до одного часа, но мышечных клеток ухудшается, как это отражено как увеличение последовательного сопротивления. Когда это происходит эксперимент либо прекращено или иной мышечной клетки является патч зажаты. Все записи должны быть завершены в течение одного часа. Рисунок 1. Записи потенциальных motorneuron действия (AP, вверху) и соответствующей мышцей концевой пластинки тока (EPC, внизу). Потенциал действия на нейрон РПЖ должна выброс +40 мВ и EPC должен вырасти в пределах 300 мкс и распад по экспоненциальному учебного времени с постоянной времени менее 1 мс. Имя Рецепт Ванна решения (в мм) 134 NaCl, 2,9 KCl, 2,1 CaCl 2, 1,2 MgCl 2, 10 Глюкоза, 10 Na-HEPES, рН 7,8 Ванна Решение с Tricaine Ванна раствор, содержащий 0,02% tricaine Ванна Решение формамидом Ванна раствор, содержащий 2М формамида Нейрон внутреннее решение (в мм) 115 К-глюконат, 15 KCl, 2 MgCl 2, 10 K-HEPES, 5 K-EGTA, 4 Mg-АТФ, рН 7,2 Мышцы внутреннее решение (в мм) 120 KCl, 10 K-HEPES, 5 BAPTA, рН 7,4 Таблица 1. Solutions.