Induites par l'environnement changements héréditaires dans lin

1. La croissance du lin dans des conditions d'induction. 5 "pots sont remplis de terre et raffermie. Trois graines par pot sont plantés ¼ de pouce de profondeur et le sol raffermi au cours des graines. Les pots sont ensuite arrosées avec 100ml de solutions appropriées en nutriments Le non-induisant de contrôle (C) des conditions d'utilisation une force 1 / 10 ème Miracle-Gro chaque semaine. La condition élevée en éléments nutritifs (NPK traitement) avaient Miracle pleine force appliquée Cultivez hebdomadaire. Faible en nutriments – les plantes que l'eau du robinet avait appliqué tout au long de leur croissance. (Durrant 1971, Cullis, 1980). Les plantes sont cultivées sous lumière naturelle durant l'été. Pendant l'hiver, ils sont cultivés sous les lumières de sodium avec un 16 / 8 heures cycle lumière / obscurité. A intervalles hebdomadaires feuilles et les méristèmes sont prélevés. Le matériel végétal est rapide congelés dans l'azote liquide. Résultats Les trois génotypes différents croître à des taux relatifs en fonction des conditions (figure 1). Par conséquent, dans des conditions de contrôle de la ligne Pl pousse mieux avec L plus vigoureux que S (figure 1a). Sous nutriments faible (eau), S pousse mieux que ce soit L ou Pl (figure 1b). Sous élevée de nutriments (NPK) L pousse mieux que Pl qui ne pousse que légèrement mieux que S (figure 1c). Une comparaison entre chacune des lignes cultivées sous les trois traitements différents est montré dans la figure 1 D – F. Pl. pousse mieux dans des conditions de contrôle (figure 1d), la meilleure L sous nutriments élevé (figure 1e) et S de la même sous les deux nutriments élevés et des conditions de contrôle (Figure 1f). Ces données montrent que les trois lignes peuvent être différenciés en fonction de leur croissance dans les trois environnements. Il est à noter que les Pl. pousse mieux dans les conditions de contrôle tandis que L pousse mieux dans les conditions NPK (sous lequel elle a été induite). S grandit peu près le même dans tous les trois conditions, qui est, il n'est pas en mesure de profiter de l'amélioration des conditions de nutriments, mais est mieux en mesure de croître sous conditions de très faible en éléments nutritifs. Les paramètres de croissance qui sont pertinents pour la différenciation des plantes comprennent la hauteur de la plante (et associés à cette longueur internodale l', qui est la distance entre chaque feuille), la taille des feuilles et le degré de ramification. Pour Pl. dans des conditions de contrôle de l'usine est grand avec des branches et les feuilles sont vertes grande et sombre. Sous nutriments peu la plante est très court, la distance entre chaque feuille est également très court et les feuilles sont vertes petit et léger. Les feuilles à l'extrémité sont vert plus foncé que les plus bas de la tige. Sous haute nutriments de la plante ressemble beaucoup à celle des conditions de contrôle, sauf que les deux la tige principale et les pousses latérales sont plus courtes que dans les plantes témoins. Pour la grande genotroph les plantes sont très similaires à ceux de Pl, sauf que la croissance la plus vigoureuse en moins de nutriments élevés. Encore une fois sous les nutriments peu la plante est très court et a feuilles vert clair. Le genotroph S croît pareillement dans les trois environnements bien que les feuilles sont vert plus clair dans les nutriments faible. Cependant, dans les conditions pauvre en nutriments du genotroph S est beaucoup plus vigoureuse que ce soit de la PL ou des lignes L. 2. ARN et extractions d'ADN à partir de méristèmes de lin et les feuilles sont faites séparément. La Roche ARN total de préparation kit a été utilisé pour les extractions d'ARN et l'ADN de Qiagen DNeasy usine de préparation kit a été utilisé pour l'extraction d'ADN. Extraction des ARN 3 méristèmes plus quelques feuilles environnantes sont déplacés de cryovial stockage en tube Eppendorf et placées dans l'azote liquide avant d'être prêt à broyer. Sable stérile est ajoutée au tube et le tissu est broyé en utilisant un micropestle jusqu'en fin. 400 lyse ul / tampon de liaison de Roche ARN total Prep Kit est ajoutée et le tissu est broyé encore jusqu'à ce qu'il n'y touffes sont visibles. L'échantillon est vortexé pendant 15 sec à l'aide de lyse puis centrifugée pendant 1 min à 13000 rpm pour recueillir du sable et des débris. Le surnageant est ajouté à tourner la colonne et le reste des instructions ARN Prep Kit sont suivies comme indiqué. DNAse traitement 1 / 10 volume d'échantillon d'ARN de DNAse tampon 10X est ajouté. 30 unités de DNAse est ajouté et la réaction est incubée à 37 ° C pendant 30 min et 70 ° C pendant 5 min. Reverse Transcription Applied Biosystems ARN pour kit d'ADNc est utilisé selon les directives, la réaction incubées à 37 ° C pendant 1 heure et 95 ° C pendant 5 minutes. L'ADNc est ensuite utilisée dans la PCR ou pour qPCR qPCR qPCR été réalisée en utilisant une étape ABI Un système. Tous les essais ont été réalisés en triple sur chaque course. Le gène de l'actine a été utilisée comme un contrôle du nombre de copies quele gène de mieux ménager disponibles. La paire d'amorces appropriée a été ajouté à chaque tube dans 1 microlitre. L'ADNc a été dilué à la concentration appropriée et 9μl ajouté à chaque tube 10 ul de l'Alimentation 2x SYBR Green PCR MasterMix (ABI) et a été ajouté à chaque tube Le programme d'amplification du programme a été: 10 minutes à 95 ° C 40 cycles de 15sec à 95 ° C, 1 min à 60 ° C Étape de dénaturation thermique afin de vérifier la spécificité d'amplification Les niveaux d'expression relative ont été déterminées par la valeur de 2 (CTunknown – CTactin). Préparation de l'ADN Tampon AP1 de Qiagen DNeasy DNA Plant Prep Kit est ajouté à 6 feuilles avec du sable stérile dans un tube de centrifugeuse. Le tissu est broyé avec micropestle jusqu'à ce qu'il n'y touffes sont visibles. Les instructions du kit sont suivies comme indiqué. Résultats L'amplification par PCR de l'ADN isolé à partir de feuilles à différentes positions le long de la tige montre que l'apparition de LIS-1 survient alors que les plantes poussent dans des conditions induisant (4). Les résultats qPCR montrent que la présence de LIS-1 (ou d'autres modifications génomiques associées à l'induction) affecte l'expression des gènes dans le voisinage immédiat de la LIS-1 (figure 2). Les six gènes montre la figure 2 sont tous exprimés différentiellement dans Pl et S avec quatre ayant une expression plus élevée en PL (sans LIS-1) et deux ayant une expression plus élevée dans S (qui ne sont LIS-1). Panel 1 et 2 sont les deux gènes proches du point d'insertion de la LIS-1. L'expression de ces gènes dans le s genotroph grande (qui a connu des changements induits, mais n'a pas LIS-1) et l'expression sous différentes conditions de croissance seront nécessaires pour déterminer une relation causale entre le LIS-1 et les changements d'expression. Figure 1. Pl, L et S grandi sous trois régimes différents nutriments. Panneaux a – contrôle, b – nutriments bas et c – NPK. d – Pl., E – S, f – L. Panneaux d – f de gauche à droite: les nutriments bas, de contrôle et NPK. D – Pl, e – L, F – S. D'expression génique Figure 2. Autour du point d'insertion de la LIS-1. Gene 1 (inhibiteur de croissance) est immédiatement 5 'du gène LIS1 et 2 (Kip liés cycline-dépendante Identifiant inhibiteur de la kinase 3 "de LIS-1. Les autres gènes sont tous le long de la même échafaud (~ 500ko) construit à partir du séquence complète du génome du lin. S'il vous plaît cliquez ici pour voir une figure plus grande . Figure 3. Amplifications par PCR d'ADN extrait de feuilles de plantes individuelles de Stormont Cirrus cultivées sous des conditions de faible en éléments nutritifs. Les produits de PCR ont été séparés sur un agarose à 2%-TBE gel. Le site uninserted est montré dans un Panel, les deux extrémités du site insérés sont indiqués dans les panneaux B et C. Des échantillons de feuilles de 1 à 6 ont été isolés à des intervalles hebdomadaires avec l'échantillon 1 étant la plus ancienne après le semis.