本文概述了程序,准备从老鼠和转基因小鼠海马突触改变与大脑衰老和与年龄有关的神经退行性疾病如阿尔茨海默氏症,相关的研究。
啮齿类动物的海马脑片制备也许是最广泛使用的工具为调查哺乳动物突触功能和可塑性。海马可快速,轻松地从大鼠和小鼠中提取和切片仍然可行含氧人工脑脊液小时。此外,基本electrophysisologic的技术很容易应用到海马突触功能的调查,并提供了一些认知障碍的最好的生物标志物。海马脑片是在学习和记忆有关的突触可塑性机制的研究,特别是流行的。诱导长时程增强和突触效能的抑郁症(LTP和LTD)在海马(或缺乏)的变化是经常被用来描述神经表型的认知受损的动物和/或评估行动的机制益智化合物。本文概述了我们准备从老鼠和转基因小鼠海马突触改变与大脑衰老和阿尔茨海默氏病(AD)1-3相关的研究中使用的程序。使用的老年大鼠和AD模型小鼠可呈现出一套独特的挑战,习惯于在他们的研究中使用年轻的大鼠和/或小鼠的研究人员。老年大鼠有较厚的比年轻大鼠和小鼠的头骨和更严厉的结缔组织,可延缓脑提取和/或夹层,并因此否定或夸大真正的突触功能和可塑性的年龄差异。老龄化和淀粉样蛋白的病理还可能加剧在解剖过程持续的海马损伤,再复杂的生理评估得出的任何推论。在这里,我们讨论了在解剖过程中采取的步骤,以尽量减少这些问题。在“健康”和“不健康”的片从大鼠和小鼠获得的突触反应的例子,以及有代表性的突触可塑性实验。在这些动物模型(如录音解决方案组件,刺激参数)的突触功能的其他方法因素可能产生的影响进行了讨论。虽然本文的重点是对老年大鼠和转基因小鼠,新手使用切片生理,要找到足够的细节,在这里开始自己的研究,使用各种啮齿类动物模型。
在本议定书中概述的步骤将有助于确保至少为迅速有效地开展脑解剖年龄在年轻成年大鼠,。我们还提供足够的细节,对于初学者LTP和LTD成立自己的切片研究。如果老化和突触功能和可塑性AD变化的进一步探索,是您的目标之一,有至少有两个其他的方法问题,上面提到的,值得进一步考虑。首先,一些实验室已经表明的Ca 2 +:Mg2 +的比例在录音学联可以在2,10,24,25海马诱导突触可塑性的一个显着的效果。在哺乳动物脑脊液中的 Ca 2 +:Mg2 +的比例大约是(如见 26) 。然而,学联的Ca 2 + Mg2 +的比例接近2片突触功能和可塑性研究。在早期的研究中,这种做法很可能是调整,优化诱导的LTP,随后成为日常所有的可塑性研究。然而,这种做法可以在老化和AD的研究问题,因为在神经元的Ca 2 +调节的特点差异。具体来说,CA 2 +内流和/或Ca 2 +诱导的Ca 2 +释放是升高的老年大鼠和/或在AD模型小鼠神经元激活3,27-31。有限公司感应是在学联的Ca 2 +水平的微妙的变化特别敏感。我们的协议,采用2mm的钙2 +和2 mM的镁,在公司通常结果年龄,但不年轻的成年动物2,同时研究利用一个钙2 +:镁+比例接近两个,已观察到的成年人强大的公司在该没有年龄差异2,10结合减少有限公司或在32岁的大鼠。这些意见强调需要仔细考虑学联钙2 +和Mg2 +水平进行比较时,在中青年成年动物的Ca 2 +依赖可塑性。
第二个方法问题, 涉及 33突触后膜的去极化和突触强度的差异可能老化/基因型的LTP的强烈依赖。在一个典型的LTP的实验,基线和LTP的刺激强度是一般调整,以生产半最大(或三季度最大)EPSP的幅度。潜在的问题是,通常表明,老年大鼠和APP/PS1小鼠突触强度降低相对年轻和/或野生型对口,这意味着,基线EPSP值也将被更小,老年大鼠和APP/PS1小鼠。较小的EPSPS可能转化为在LTP的刺激少的去极化,导致减少的概率为诱导LTP的33。由于这种潜在的混淆,这是很难以确定是否这些动物表现出吞吐量赤字,可塑性赤字或两者。也就是说,年龄和/或APP/PS1小鼠LTP的诱导机制可能是功能完好(无可塑性赤字),但在这些条件下不够刺激(吞吐量赤字)。这个区别是至关重要的,吞吐量和可塑性机制机制的反应可能非常不同的一个特定的药物治疗。我们尽量减少吞吐量降低的LTP诱导的影响,通过规范的所有片LTP的刺激前EPSP的幅度相同的水平(如为1 mV)。其他策略可能会有效,以及(如电压或电流钳的使用,以平衡各群体之间在膜电位的LTP的刺激),并调查在这些动物模型的LTP时,应考虑。
The authors have nothing to disclose.
由美国国立卫生研究院授予AG027297,从肯塔基脊髓和颅脑损伤的研究信托奖,并从Kleberg基金会的礼物支持的工作。
Name of the reagent | Company | Catalogue number |
NaCl | Fisher | BP358-1 |
KCl | Fisher | BP366-500 |
KH2PO4 (monobasic) | Sigma | P5379-100G |
MgSO4 | Sigma | M2643-500G |
CaCl2 (dihydrate) | Sigma | C3306-250G |
NaHCO3 | Fisher | S233-500 |
C6H12O6 (dextrose) | Fisher | BP350-1 |
Table 1. Reagents required
Name of the equipment | Company | Catalogue number | Comments |
Erlenmeyer Flasks | Fisher | FB-500-2000 FB-500-1000 |
|
Aquarium Bubbler | Used for oxygenating media. Available at most pet stores | ||
50 mL Glass beaker | Fisher | 02-540G | For brain storarge in ACSF |
Parafilm | Fisher | 13-374-10 | |
Small Animal Guillotine | World Precision Instruments (WPI) | DCAP-M | |
Flat paper towel | |||
#11 Feather surgical blade | Fisher | 08-916-5B | |
Beebee bone scissors | Fine Science Tools (FST) | 16044-10 | |
Lempert Rongeurs | Roboz | RS-8321 | Use for rats |
Friedman-Pearson Rongeurs | FST | 16020-14 | Use for mice or rats |
Hippocampus tool | FST | 10099-15 | |
Spoon | A plastic teaspoon will do | ||
Spatula | Fisher | 21-401-25A | Spatula |
Surgical iris scissors | FST | 14058-09 | |
plastic transfer pipets | Fisher | 13-711-43 | |
110mm Whatman filter paper | Fisher | 09-805E | Whatman cat. 1001-110 |
Glass petri dish | Fisher | ||
Leica VT1000P Manual Vibrating Microtome | Vibratome | VT1000P | |
0.1mm FA-10 Feather S blade | Ted Pella | 121-9 | 0.1mm FA-10 Feather S blade |
Borosilicate Glass Pasteur Pipet (with rubber bulb) | Fisher | 13-678-20A | For transferring slices: Tip is broken off and heat-polished for larger opening |
35 mm Polysterine Culture dish | Corning | 430588 | Used for collecting slices after dissection |
Table 2. Tools and materials for dissection
Equipment/Materials | Company | Comments (optional) |
Holding chamber | Custom Built | |
P-97 Horizontal Pipette Puller | Sutter Instrument Co. | |
Vibration isolation table | Technical Manufacturing Corporation (TMC) | |
Faraday cage | Custom built | |
Pyrex Aspirator Bottle with Bottom Sidearm (Product #1220-1L) | Corning | |
Gravity-contolled IV set with regulator (Product # 2C8891) | Baxter | |
Central Vacuum Line | Available in most modern labs | |
95% O2 / 5% CO2 Gas Mix | Scott-Gross Co. | |
TygonTM Lab tubing For O2/CO2 delivery |
Fisher Scientific | Non-toxic, non-oxidizing, comes in a variety of sizes. |
Eclipse E600FN Microscope | Nikon | with 10x and 40x objectives, near infared filter, and GFP,DS-Red2 filters |
Cool Snap ES Digital Camera | Photometrics | Cool Snap ES Digital Camera |
X-Cite Fluorescent Illuminator | EXFO | X-Cite Fluorescent Illuminator |
Microscope Platform | Siskiyou | Custom assembled |
RC-22 Submersible recording chamber (Product # 64-0228) | Warner Instruments (WI) | Requires P-1 platform and stage adaptor (Product # 64-0277 From Warner) |
TC2BIP 2/3Ch Temperature controller | Cell Microcontrols | TC2BIP 2/3Ch Temperature controller |
4 Axis Manual Miniature manipulator | Siskiyou | |
Platinum Iridium Wire (0.002 in) (item # PTT0203) |
WPI | |
A365 Stimulus Isolator | WPI | A365 Stimulus Isolator |
Multiclamp 700b Amplifier | Axon Instruments | |
Digidata 1322A A/D converter | Axon Instruments | |
PClamp software | Axon Instruments | |
Personal Computer (Pentium 4) | Dell |
Table 3. Electrophysiology equipment and materials