크레이 피쉬 복부 근육 수용체 기관 : Proprioception에서 학생 실험실 연습

1) 소개 Proprioceptors가 공동 위치, 방향, 속도, 그리고 근육 스트레칭을 감지 뉴런 있습니다. proprioceptors 대신 외부 세계에서 본문 내에 interoceptors 및 감각 자극 때문에 Proprioception는 독특한 감각 양상이다. 척추 시스템에서는, 그것은 공동과 긴장 수용체의 많은 총 고유 정보를 검색할 필요가 없다는 것을 나타납니다. 근육 섬유 annulospiral 및 flowerspray (감각 신경 엔딩) 수용체는 proprioception에 필요한 두 가지 중요한 수용체 그룹으로 절제뿐만 아니라 진동과 마취 연구에 의해 표시되었습니다 (버지스 외. 리뷰, 1982 용). 그러나, 그것은 움직임의 미세 제어에 사용되는 등 관절에있는 것과 다른 수용체, 수집한 중복 정보가있다는 것을 주목할 수 있습니다. 척추 동물과 같은 Arthropods은 관절 부속되어 있습니다. 따라서 척추 동물에 대한 설명 proprioceptors가 arthropod 팔다리와 관절에서 대응 것은 놀라운 일이 아니다. 게는에 chordotonal 장기의 해부 학적 배열은 기능에 따라 각 신경 세포의 분석을 수 있습니다. 또한, 개발 질문은 동물이 성장함에 따라 해결이나 동물이 사지 (쿠퍼와 고빈드, 1991; 하트먼와 쿠퍼, 1993)를 다시 생성하면됩니다. 게는의 일부 공동 chordotonal 기관 일차 감각 뉴런의 수백을 포함 (쿠퍼, 2008) 이러한 뉴런은 공동의 움직임과 위치의 범위 분류의 측면을 모니터링합니다. 공동 움직임과 위치를 모니터링 덜 복잡 고유 시스템 왕새우의 복부에있는 근육 수용체 기관 (MROs) (; 맥카시와 맥밀란, 1995 에커트, 1961a, B)입니다. 크레이 피쉬 복부 MROs의 mechanoreceptors는 등급 수용체 잠재력에 근육에 포함된 감각 엔딩,의 스트레치 자극을 transduce. 가능성이 임계값을 초과하면, 액션 잠재력은 축삭 기지에서 얻을 수 있습니다. 이것은 신경 생물학에서 "급증 개시의 사이트"로 정의되고 알려진 이유입니다. 이 시스템에서 세포 기관은 모니터 근육에 가까운 동격에 있습니다. 스트레치 수용체의 별개의 두 가지 유형이 감각 시스템에 존재 : 천천히 적응하고 빠르게 – 적응 수용체. 활동은 기계 스트레치의 강도에 따라 달라집니다. 크레이 피쉬의 MRO 시스템은 포유류의 intrafusal 근육 스핀들에 유사하고 근육도 포유류에 intrafusal 근육 알려져으로 근육의 긴장 자연을 유지하기 위해 efferent 제어할 수 있습니다. 포유류의 근육 스핀들 감각 뉴런 때문에 감각 엔딩의 작은 자연 electrophysiologically 조사를 도전하고 있습니다. 그것은 그들의 주변 엔딩에 지느러미 루트 신경절에 세포 기관의 위치를​​ 추적하는 것도 어렵습니다. 비교에서, 왕새우의 MRO의 뉴런은 장기적인 레코딩을위한 세포 및 세포내 전극에 대해 쉽게 액세스할 수 있습니다. MRO 감각 뉴런의 세포 기관은 (직경 50-100 μm의) 상대적으로 큽니다. . 에드워즈 외, 1981,,. Erxleben, 1989 감각 뉴런은 뉴런 기능에 채널, 감각 뉴런의 이온 흐름, 채널 유통, 그리고 밀도 (브라운 외, 1978 "스트레칭 활성화"어떻게 대응의 모델 역할을했습니다; 사냥 외, 1978;. Purali과 Rydqvist, 1992; Rydqvist 및 Purali, 1991; Rydqvist 및 Swerup, 1991; 쿠퍼 외, 2003).. 한 세그먼트의 MRO에서 감각 입력의 통합은 다른 인접한 세그먼트 (에커트, 1961a, b)는 영향을 미칠 수 있습니다. 에서 감각 입력의 변조에 대한 몇 가지 보고서가있다 MRO (Pasztor과 맥밀란, 1990;. 쿠퍼 외, 2003). 신경 회로의 변조는 기초 과학의 미래를 수사 풍부한 지역이며 준비는 척추 동물의 척수 코드에 잠재적으로, 미래의 애플 리케이션을위한 포유류의 기초로 검색할 수 있습니다 (로시그놀 외, 2001, 2002;. Donnelan 2009) 1.1) 학습 결과 이 실험실 실험에서, 하나는 왕새우의 복부를 절개하다와 관련된 해부 및 MRO의 생리를 배우게됩니다. 하나는 세포외 레코딩로의 연결 작업을 모니터링하는 방법을 배울 수 및 일반 electrophysiological 장비를 사용할 수 있습니다. 하나는 그래프와 데이터가 제공 감각 자극에 따라 획득 해석됩니다. 감각 자극이 정적 위치뿐만 아니라 모니터링되는 세그먼트의 역동적인 움직임의 범위 것입니다. 하나는이 감각 시스템 및 그 중요성에 proprioception의 개념을 해결합니다. 감각 적응은 일련의 실험에서 관찰됩니다. 의미뿐만 아니라 감각 adaption 뒤에 잠재적인 메커니즘은 학생들이 해결될 것입니다. 2) 방법 2.1) 자료 <oL> 패러데이 케이지 Micromanipulator 흡입 전극 해부 현미경 고강도 조명기 (광원) 현미경 플랫폼 AC / DC 차동 증폭기 (AM 시스템 주식 회사 모델 3000) PowerLab 26T (AD 악기) 헤드 단계 LabChart 7 (ADI 인 스트 루먼트, 콜로라도 스프링스, CO, 미국) 크레이 피쉬 살린 (MM : 205 NaCl, 5.3 KCl, CaCl 2 0.2 13.5 H 2 O, 2.45 MgCl 2 0.6 H 2 O, 5 HEPES 산도 7.4로 조정) 메틸렌 블루 : 이것은 0.25 %의 농도에서 크레이 피쉬 호수로 만들어진 것입니다 Sylgard 코팅 요리 (다우 코닝, SYLGARD 184 실리콘 엘라스토머 키트,. 다우 코닝 주식 회사, 미들랜드, MI 미국) 해부 도구 곤충 핀 2.2) 설치 그림 1 : 장치가 설정 패러데이 케이지를 설치합니다. 현미경, 높은 강도 조명기, micromanipulator 및 생리 욕조는 모두 케이지 (패러데이 케이지가 전기 녹음에 영향을 줄 수 있습니다 외부 전기 분야를 차단하는 데 사용되는) 안에 설치됩니다. 이것은 현미경의 무대를 바라보고있는 위치에 현미경을 설치합니다. 편리한 위치에 높은 강도 조명기를 놓습니다. Sylgard 접시에 크레이 피쉬 호수를 사용하여 호수 목욕을 준비하고 (해부 왕새우의 복부가 배치됩니다 곳입니다) 현미경으로 그것을 놓으십시오. 흡입 전극이 호수 목욕탕에 쉽게 접근할 수있는 위치에 micromanipulator를 놓습니다. 흡입관은 그것은 흡입 전극 내부의 은색 철사와 접촉에 생리 때까지. 전극의 끝부분에 가까운 흡입 전극의 컷 – 측면에 다른 전선을 마련, 두 전선이 호수 목욕탕 접촉을 받게 될 것입니다. 파워 랩 26T로 AC / DC 차동 증폭기 (앰프)를 연결합니다. PowerLab 26T에 입력 1에서 앰프의 출력에 적절한 코드를 연결하여이 작업을 수행합니다. 증폭기 악기 컨트롤은 다음과 같은 설정을 설정해야합니다 : 하이 패스 – DC 노치 필터 – OFF 패스 – 20kHz 낮음 용량 컴프 .- 반시계 DC 오프셋 노프 – 시계 반대 파인 물론 DC 오프셋 (+ OFF -) – OFF 게인 노브 – 50 입력 (모노 비교 GND) – 비교 모드 (STIM – GATE – REC) – REC ΩTEST – OFF '입력 프로브'앰프에에 머리 단계를 연결합니다. 흡입 전극에서 머리 단계로 전기 전선을 연결합니다. 와이어가 검은 중간에 녹색이 (지상), (맨 아래에있는 부정, 왼쪽 상단에 (긍정적인) 빨간색과 연결되어 있어야합니다. 이것은 그림 2에 표시됩니다. 접지 와이어가 방금 살린 욕탕에 넣어 수 있습니다. 그림 2 : 헤드 단계 구성 이제 노트북에 PowerLab의 26T에서 USB 코드를 연결합니다. 앰프와 PowerLab26T 모두에 연결되어 있고 컴퓨터에 LabChart7을 열기 전에이 켜져 있는지 확인하십시오. LabChart7를 엽니다. LabChart 웰컴 센터 상자가 열립니다 나타납니다. 그것을 닫습니다. 설정을 클릭하십시오 채널 설정을 클릭합니다. 확인을 누르면 1 (상자의 왼쪽 하단)에 채널 번호를 변경합니다. 차트의 맨 왼쪽에 2K 약 초당 사이클로 설정합니다. 약 500 200mv로 볼트 (Y 축)을 설정합니다. 차트의 오른쪽에 채널 1을 클릭합니다. 입력 앰프를 클릭하십시오. 않도록 설정 : AC 결합, 단일 종단, 그리고 반전 (필요한 경우 신호를 전도), 그리고 안티 – 별칭, 확인합니다. 기록 프레스 시작를 시작합니다. 2.3) 해부 신체 길이 크레이 피쉬 (Procamarus clarkii) 측정 60-10센티미터는 이미 해부가 시작하기 전에 동물을 마취하기 위해 얼음에 배치해야합니다. 한손으로 발톱 뒤에서 anesthetized 왕새우를 잡아. 신속, 눈 소켓에서 양쪽 머리의 중간에 잘라 다음 왕새우 (참고 : 준비에서 혈액이 완료되었을 때 그것이 마르면 때문에 도구를 씻어 쓰는 것입니다)을 참수 형에 처하다. 그림 3 : 왕새우 목베기 일단 크레이 피쉬는 복부 측면에 흉부와 복부 (꼬리) 사이 컷, 참수 수 있습니다. 이것은 흉부에서 복부를 분리하기 쉽게한다. 참고 : 왕새우가 남자 경우, styl 잘라에서 복부와 흉부를 분리하기 전에 ETS (남성의 생식 부분). (그림 4A 아래 참조). 그림 4 : 복부의 분리 복부 내부, 그리고 가위 팁 멀리 측면 경계 잘라 준비에서 가리키는과 가위 중 하나 블레이드를 배치합니다. 반대편에 반복합니다. 그림 5 : 복부의 세로 절개 족집게의 끝에서 (# 3) 타고 거리 준비 등의 측면에서 근육과 GI 트랙트 밀어. 근육에 내려와서하지 않도록주의하십시오. 꼬리의 복부 측면을 제거하는 (수평쪽으로 측면) 마지막 늑골을 가로질러. 그림 6 : 복부의 복부 부분의 제거 크레이 피쉬 호수 (수정 반 Harreveld의 ​​솔루션)의 준비를 등장. 현미경 준비 보면서 깊은 신근 중간 근육 (DEM)은 선형 섬유와의 나선으로 꼬인 섬유, 그리고 깊은 신근 측면 근육에 의해 찾을 수 있습니다 (부록 피규어 1 & 2 참조) 구별하실 수 있습니다. 첫 번째와 두 번째 늑골 (그림 7)에서 DEM 근육 사이의 복부의 말초 부분에서 midsagittal 지역의 두 개 핀. 그림 7 : 감각 MRO 신경을 포함한 신경을 기록에 대한 준비를 확보. 표피 (그림 7) 옆에있는 측면 가장자리에서 실행 기록하는 데 사용됩니다 신경 몫이야. (그것은 준비에 타격 또는 그 운동 신경을 찾으 스포이트를 사용하여 목욕으로 생리를 드롭해야 할 수도 있습니다) 참고 : 각 복부 세그먼트는 오른쪽과 왼쪽 hemisegments에 빠르게 적응하고 천천히 MROs 두 가지가 있습니다. 관련 신경 번들은 표피 옆에있는 측면 가장자리 실행합니다. 이것은 하나의 기록됩니다 신경의 번들입니다. 그들이 DEL1 2 근육 (부록 피규어 1 & 2) 아래에 위치하기 때문에 하나는 MROs을 볼 수 없습니다. 그림 8은 복부를 분리하기 위해 만들 수있는 해부에 대한 개요를 제공합니다. 그림 8 : 복부를 분리하기 위해 일반적인 해부의 개요. A, B, 그리고 C는 왕새우를 해부에 단계 시리즈입니다. 3) 결과 3.1) 녹음 천천히, 그리고 스트레칭과 스트레칭을 유지하면서 MROs를 빠르게 – 적응에서 얻은 일반 응답 그림 9에 그려져 있습니다. 자신의 axons이 동일한 신경 번들에 포함되어있는 본 행사 중 하나는 함께 두 MROs에서 기록됩니다. 그림 9 : 왕새우는 MRO에서 뉴런의 두 가지 유형이 있습니다. 빠른 모터 axons, 그리고 느린 모터 axons에 의해 innervated하는 토닉에 의해 innervated하는 phasic. (A) 토닉 수용체가 자극되면 천천히 자극에 적응 및 행동 잠재력의 꾸준한 발사 패턴을 계속합니다. (B) phasic 수용체가 자극되면 그것은 빠르게 자극에 적응에만 실천 가능성에 대한 간단한 패턴을 발생합니다. 모터와 감각 뉴런을 포함하는 전체 신경은 (그림 10)에서 기록됩니다. 그러나 한은 모터 드라이브가 동물의 복부 신경 코드에서 단절되었다 같은 감각 뉴런을 감지합니다. 그림 10 : 레코딩 전극의 소용돌이로 신경 번들. (A) 자유 신경은 복부를 해부를 통해 떠있는 표시됩니다. (B) 신경 번들과 신경에 의해 플라스틱 흡입 전극 가까이를 설명합니다. (C) segmental 신경이 파란색으로 설명하는 흡입 전극, 정차할 수 있습니다. 하나는 지금 MROs의 전기 반응을 기록하도록 준비가되어 있습니다. 절개 범위에서 준비를 놓고 녹음 설정을 준비합니다. 전기 욕조 및 공통 접지에 다른 한쪽의 실버 염화물 접지 와이어를 배치하여 목욕을 지상. 참고 : 때때로 이것은 녹음하는 동안 전기 노이즈가 발생할 수 있습니다. 이 경우 목욕을 접지하지 않습니다. 기록에 신경을 찾기 위해 현미경을 사용하여 참고 : 대부분의 접근 신경으로 세그먼트를 찾습니다. 신경이 흰색이고, 또는 신경 주위에 호수를 스프레이로 피펫을 사용하여 볼 수 있습니다 가볍게 준비에 불어로. 이것은 이동에 신경을 원인과 식별하기 쉽게합니다. 신경에 직접 신경을 통해 micromanipulator (그림 10)에서 흡입 전극을 배치 확인되었습니다 이제. 부드럽게 전극 (하나는 현미경의 사용으로 전극에 빨려 신경을 볼 수 있습니다)에 신경을 그릴 수있는 주사기를 당겨. Labscop​​e7에있는 시작 버튼을 누릅니다. 족집게를 사용하면 부드럽게 180-45 90 각도에서 왕새우 꼬리를 이동 아래로. 각기 다른 각도에서 녹음의 차이를 확인합니다. (각도의 위치를​​ 변경하면하면 화면의 관련의 연결 활동으로 각도 변화를 참고해야합니다. 이것은 소프트웨어의 주석 마커를 사용 할 수 있습니다.) 아래의 차트에 여러 정적 움직임에 대응 움직임을 기록합니다. 십오초에 45 °에서 왕새우의 꼬리를 잡아. LabChart7 화면에 정지 푸시. 기록된 마지막 순간 동안 발생 행동 잠재력의 수를 기록합니다. 일분 45 °에서 왕새우의 꼬리를 잡아. LabChart7 화면에 정지 푸시. 기록된 마지막 순간 동안 발생 행동 잠재력의 수를 기록합니다. 설명 : 랩 차트 화면이 대 초 (X 축) milliVolts에 움직이는 그래프 (Y 축)입니다. 그것은 특정 시간에 발생하는 얼마나 많은 작업 잠재력 측정합니다. 또한 각 작업의 가능성 또는 세포외 필드 가능성 볼트의 진폭을 측정합니다. 진폭은 세포외 기록 액션 잠재력의 다양한 크기가 존재하는지 확인하는 데 사용할 수있는 상대적인 측정하기위한 한 방법입니다. 세포외 분야의 잠재력에 의해 기록된 행동 가능성은 '대못'이라고합니다. 멀리 떨어진 신경에서 작은 스파이크 될 것이다. looser 흡입에 피팅은 전류가 신경 번들 주변의 낮은 인장 저항과 흡입 전극 개방과 손실로 작은 스파이크가 될 전극. 표 1 : 각도 (°) # 3 초 후 일초의 액션 후보의 # 액션 후보의 일초에 10 초 후 180 ° (플랫) 45 ° 90 ° 이러한 실험을 실시하면서 생각하는 질문은 다음과 같습니다 패턴과 공동의 확장과 굴곡 운동 일관성있는 응답이 있습니까? 응답의 무엇이 종류의 다양한 고정 위치에서 텔슨을 달아하거나 누른 evoked입니까? 반복 때 반응은 일치하나요? 관찰된 반응의 종류주의 노트를 확인하십시오. 당신이 당신의 관찰 만족 후 데이터 파일을 저장하여이 활동의​​ 영구적으로 기록합니다. 일단 세그먼트 3에서 만들어진 것을 관찰 만족, 세그먼트 4 또는 5의 신경에서 추가 녹음에 또는 활동을 관찰하기 위해 세그먼트 3의 반대편에 이동합니다. 하나는 neuromodulators (octopamine, 세로토닌, 그리고 proctolin) 또는 다른 물질이나 염분의 이온 자연 개조 구성이 정의된 호수에서 얻은 이들의 다양한 반응을 생산하고 있는지 확인하실 수 있습니다. 메틸렌 블루와 함께 3.2) 스테 이닝 하나는 얼룩 기술로 MROs을 보려면 (부록 참조) 근육을 절개하다 수 있습니다. 준비를 가지고 크레이 피쉬 살린 좀 따​​라줘. 준비와 부드럽게 소용돌이 몇 분 동안 요리를 메틸렌 블루로 솔루션의 약 5 MLS를 놓습니다. 그런 다음 쓰레기 컨테이너에 여분의 메틸렌 블루 잔하고 준비에 신선한 호수 잔. 이제 MROs를 볼 수있는 근육 해부 시작 현미경으로 접시를 놓습니다. 근육 아래 가위의 한 부분을 배치하고 근육을 따라 잘라로서 당겨 갈비뼈 (midsagittal하는 측면)을 따라 세그먼트를 잘라요. 일단 DEL 1과 2 근육은 근육을 다시 껍질 후 절단하고 근육의 얇은 층 (SEM)을 관찰해야합니다. MROs은 나선형의 근육 (그림 11)에 평행하게 누워 마지막 두 중간 섬유입니다. "고도는 ="그림 11 "/> 그림 11 : 복부 세그먼트의 개략도는 근육 그룹 (A), 파랑 (B)가 손상 준비에 근육 그룹을 윤곽을 그리다하는 데 도움이 메틸렌과 스테인드 준비를 보여줍니다. 의 설명 영역 확대와 B로 표시됩니다. 회로도의 아래쪽에 그림과 같이 A에서와 같이 B에서 DEL1 2 근육 그룹은 버려야하지 않습니다 학생 운동에 대해 하나는 학생들이 다음과 같은 질문에 대한 답변이 그러하기를 바라는 : interoceptive 수용체는 무엇입니까? 어떻게 interoceptive 수용체가 proprioceptors 관계합니까? 감각 적응하고 어떻게이 연구소에 관련된 수를 설명합니다. 범위 분별 (분리)는 무엇입니까? 그것은 무엇을 CNS 할 수 있습니까? 신경 세포는 phasic 또는 강장제 타입 신경을 기록인가? 왜? (힌트 : 당신은 모터 신경 세포 활동이 그대로 동​​물 이내에 감각 신경 활동과 관련하여 어떻게 생겼 을까 무엇을 가정 것입니다) 종이 별도의 시트에 AP의 주파수 대 왕새우 꼬리의 각도의 그래프를 그립니다. 그래프가 관찰 수도있는 동향을 설명