Den här artikeln visar hur man genomför elektrofysiologiska inspelningar av synaptiska svar på extensor muskeln i går benet av en kräftor och hur nervändslut visualiseras för att visa de grova morfologiska skillnaderna mellan hög-och låg-utgångsplintar nerv.
Vi förklarar i detalj hur man exponera och genomföra elektrofysiologiska inspelningar av synaptiska svar för hög (phasic) och låg (tonic) utgång motoriska nervceller innervating extensor muskeln i går benet av en kräftor. Tydliga skillnader finns i fysiologi och morfologi phasic och tonic nervändslut. Den tonic Axon innehåller många fler mitokondrier, som gör det möjligt att ta en viktig fläck mer intensivt än phasic axonet. Den tonic terminaler har varicosities och phasic terminalen är filiform. Den tonic Terminalerna är låga i synaptisk effekt men visar dramatiska underlättas svar. Däremot phasic terminalerna är höga i quantal effekt men visar synaptisk depression med hög frekvens stimulering. Den quantal effekt mäts med en samlingspunkt macropatch elektrod placeras direkt över visualiseras nervändslut. Både phasic och tonic terminaler innerverar samma muskelfibrer, vilket tyder på att inneboende skillnader i nervceller, snarare än differentiell bakåtsträvande feedback från muskel, står för den morfologiska och fysiologiska differentiering.
Vi har visat i denna rapport hur man dissekera, spela in och mäta synaptiska svar i en unik kräftor neuromuskulär förberedelse där både hög och låg-utgångsplintar innerverar samma muskelfiber. Den neuromuskulära förberedelser i kräftor erbjuder många fördelar jämfört med ryggradsdjur neuromuskulära korsningar, eftersom endast ett fåtal excitatoriska motoriska nervceller behövs för att innerverar en muskel, och eftersom nervceller kan identifieras från förberedelse till förberedelse (Atwood, 1976). Dessutom är den excitatoriska neurotransmittorn glutamat, och den excitatoriska postsynaptiska potentialer (EPSP) är graderade, alltså, de biofysiska egenskaper graderade händelser är analogt med dendriter av nervceller i CNS hos ryggradsdjur. Den quantal strömmar, kan dock följas direkt på postsynaptiska webbplatser (Cooper et al., 1995).
Repetitiva 5 Hz stimulering av phasic nerv ger upphov till stora EPSPS som i hög grad blir deprimerade efter flera minuter. Denna typ av depression är vanligt i leddjur phasic neuromuskulära korsningar (Atwood och Cooper, 1996). Förekomst av tonic terminaler längs phasic terminalerna gör att man kan bedöma om den postsynaptiska mål är kraftigt modifierad under och efter depressionen under phasic motoriska neuron. Dessutom låg utgångar ger en fin förberedelse för att undersöka mekanismerna som ligger bakom synaptiska underlättande (Desai-Shah et al, 2008;. Desai-Shah och Cooper, 2009)
Den höga utgångarna ger en lekplats för att undersöka modulering i graden av synaptiska depression och återhämtningsprocessen. Tillgängliga och livskraftiga preparat bör hjälpa till att dechiffrera mekanismerna bakom synaptisk depression. I detta kräftor benböjning beredning, är exogen tillämpning av serotonin annat verktyg för att undersöka återvinning av synaptiska depression och eventuellt ett sätt att främja utredningen av mobiliseringen av synaptiska vesikler pooler. Detta preparat innehåller flera experimentella fördelar, eftersom enskilda muskelfibrer innerveras av både phasic och tonic motoriska nervceller.
Eftersom serotonin ökar antalet blåsor som släpps med framkallade stimulans, och eftersom det främjar återhämtning under depression, är det uppenbart att det finns en viss modulering av vesikler pooler för att öka sannolikheten för fusion med serotonin närvarande (Johnstone et al. 2008 ; Logsdon et al, 2006;. Sparks et al, 2004).. Modeller som skulle förklara dynamiken i vesikler pooler inom presynaptiska nervändsluten under lågfrekvent stimulering, i motsats till en deprimerad tillstånd, måste också anses vara bland de olika experimentella protokoll som är möjliga med denna beredning.
Det har konstaterats i andra system att ca 30% av vesikler poolen genomgår en snabb återvinning, medan resten av återvunna blåsor gå igenom en traditionell långsam återvinning väg genom endoplasmatiska retiklet (Harata et al, 2001;. Tsien et al. , 2001). Sådana dubbla vägar kan också finnas i detta system. Om ATP saknas i den deprimerade tillståndet i presynaptiska terminalen, då lastning och lossning kanske inte kan ske, och därför skulle många fler lossas blåsor kvar på synaptiska ytan. Eftersom fler blåsor snabbt frigörs när terminalerna är utsatta för 5 HT, är det möjligt att mer ryms inom de lätt öppningsbara poolen (RRV). Men i sitt deprimerade tillstånd med minskad ATP kan lastning och lossning blockeras även i närvaro av 5 HT, som återigen lämnar lossas blåsor vid synaptisk ytan. Eftersom de preliminära uppgifterna tyder på att fler blåsor släpps över tiden med förlängd 5 HT exponering och stimulans, fördelningen av vesikler poolen från den snabba och långsamma återvinning vägar kan vara sned att ha kompetenta vesikler för ny-release (från Johnstone et al. 2008; se recensioner-Desai-Shah et al, 2008;. Desai-Shah och Cooper, 2009)
Med de metoder för centrala macropatch inspelningar av postsynaptiska strömmar och åtgärder av enskilda kvanta från definierade områden av motorn nervändsluten kan man ställa frågor för att avgöra om synaptisk depression sker som en följd av färre blåsor släpps eller på grund av förändringar i funktionen av postsynaptiska receptorer. Det har visat att blåsor är mer känsliga för fusion vid phasic NMJ av denna förberedelse för en lika kalcium exponering (Miller et al. 2005), som sannolikt står för den högre genomsnittligt quantal innehåll phasic terminaler (Msghina et al. , 1998, 1999). Dessutom kan skillnader i kalcium bindande protein frequenin (Jeromin et al., 1999) och ultrastruktur (King et al., 1996) bidrar till den differentiella synaptiska effekten (Cooperet al., 2003).
Vissa tidigare studier har utforskat muskler fenotyp av extensor muskelfibrer (Bradacs et al, 1997;. Cooper et al, 2003.). Jämföra regleringen av muskeln differentiering för rent tonic och phasic fibertyper i kräftor till blandade fibertyper, som till benet extensor som slött är innerveras kan ge ledtrådar till muskler fenotyp uttryck och reglering (Laframboise et al, 2000;. Sohn et al, 2000;. Griffis et al, 2001;. Mykles et al, 2002)..
Många grundläggande frågor återstår att behandlas i neurobiologi, och denna förberedelse kan stödet i kampen mot några av dem. Några frågor av intresse inom området idag som skulle kunna närma sig med benet extensor är: 1) Fastställande av cellulära mekanismer som ligger bakom synaptisk depression inom hög-utgångar (Är depression på grund av en minskning av Ca2 + inträde, avsaknaden av en behörig lätt öppningsbara vesikler (RRV) pool, och / eller ändras postsynaptiska mottaglighet?) 2) Fastställande av mekanistiska rollen av 5-HT när den tillämpas efter induktion av synaptiska depression för att främja en snabbare återhämtning, och 3) Fastställande av huruvida formen på quantal strömmar som uppstår stimulerande phasic terminaler är att ändras under induktion av depression att ta itu med pre-och postsynaptiska komponenter i synaptisk depression.
Detta NMJ är viktigt för pågående forskning och framtida utredare eftersom det ger oss möjlighet att få relevant information som behandlar underhuggare mekanismer synaptiska prestanda som mäts direkt vid släpp platser. Aktuell forskning på detta område är att informera om modulering av synaptisk depression genom att 5-HT och dynamiken i vesikler pooler. Sådana ämnen avser de grundläggande grunderna i synaptisk transmission relevanta för alla neurala system.
The authors have nothing to disclose.
Vi tackar Mr Craig D. Slaven (Engelska institutionen, University of Kentucky) för redaktionell hjälp. Med stöd av University of Kentucky, Institutionen för biologi, Office studierektor och College of Arts & Sciences.