In tempo reale immagini di leucotriene B 4 Migrazione cellulare mediata e BLT1 Interazioni con β-arrestina
Summary
Questo documento descrive la metodologia per determinare la risposta chemiotattica dei leucociti ai ligandi specifici e identificare le interazioni tra recettori di superficie della cellula e le proteine citosoliche utilizzando vivere tecniche di imaging cellulare.
Abstract
Recettori accoppiati alla proteina G (GPCR) appartengono alla famiglia delle sette proteine transmembrana e mediare la trasduzione di segnali extracellulari alle risposte intracellulari. GPCR controllo diverse funzioni biologiche come la chemiotassi, rilascio del calcio intracellulare, regolazione genica in modo ligando dipendente tramite eterotrimeriche proteine G 1-2. Di legame induce una serie di cambiamenti conformazionali che portano all'attivazione di eterotrimeriche G-proteine che modulano i livelli di secondi messaggeri come adenosina monofosfato ciclico (cAMP), inositolo trifosfato (IP3) e glicerolo diacyl (DG). In concomitanza con l'attivazione del legame con il ligando del recettore avvia anche una serie di eventi per attenuare il recettore di segnalazione tramite desensibilizzazione, sequestro e / o internalizzazione. Il processo di desensibilizzazione dei GPCR avviene attraverso la fosforilazione del recettore per G-proteina chinasi del recettore (GRKs) e vincolante successiva β-arrestine 3. β-arrestine sono proteine citosoliche e traslocare a membrana su attivazione GPCR, legandosi ai recettori fosforilati (la maggior parte dei casi) ci internalizzazione del recettore, facilitando 4-6.
Leucotriene B 4 (LTB 4) è un pro-infiammatorie molecola lipidica derivati dal percorso di acido arachidonico e media tramite le sue azioni GPCR, LTB 4 recettore 1 (BLT1, un recettore ad alta affinità) e LTB 4 recettore 2 (BLT2, un recettore a bassa affinità ) 7-9. Il 4-BLT1 LTB percorso ha dimostrato di essere critici in diverse malattie infiammatorie tra cui, l'asma, l'artrite e l'aterosclerosi 10-17. Nel documento descrive le metodologie sviluppate per il monitoraggio LTB4-indotto migrazione dei leucociti e le interazioni di BLT1 con β-arrestina e traslocazione dei recettori in cellule vive utilizzando tecniche di imaging microscopia 18-19.
Il midollo osseo le cellule dendritiche derivate da C57BL / 6 topi sono state isolate e coltivate come descritto in precedenza 20-21. Queste cellule sono state testate dal vivo nei metodi di imaging cellulare per dimostrare LTB 4 migrazione cellulare indotta. Il BLT1 umano è stato taggati con rosso proteina fluorescente (BLT1-RFP) a C-terminale e β-arrestin1 taggati con proteina fluorescente verde (β-arr-GFP) e transfettate entrambi i plasmidi in Rat basofili Leukomia (RBL-2H3) linee cellulari 18-19. La cinetica di interazione tra queste proteine e localizzazione sono stati monitorati utilizzando vivere videomicroscopia cellulare. Le metodologie nel documento corrente descrivono l'uso di tecniche microscopiche per studiare le risposte funzionali di G recettori accoppiati alle proteine in cellule vive. Nel documento descrive inoltre l'utilizzo di software Metamorph per quantificare l'intensità di fluorescenza per determinare la cinetica dei recettori e le interazioni proteina citoplasmatica.
Protocol
Discussion
L'imaging cellulare Live è un potente strumento per dimostrare la funzione e le interazioni delle proteine specifiche che si verificano in tempo reale. I metodi descritti in questo manoscritto mostrano chiaramente che LTB 4 può provocare una rapida migrazione delle cellule dendritiche. Questi metodi non solo ampliare gli aspetti della funzione di LTB 4 tipi di cellule diverse, consentono metodi simili da applicare ad una varietà di altre chemochine e prova la loro efficacia come agenti…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
La ricerca è sostenuta dal National Institutes of concede Salute AI-52381, CA138623 e Kentucky consiglio Lung Cancer Research e il sostegno istituzionale di James Graham Brown Cancer Center.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Cell lines: | ||||
| Rat Basophilic Leukomia Cell line (RBL-2H3) or HEK293 cells. | ATCC | CRL-2256 | ||
| Media: | ||||
| Delbecco’s modified Eagle’s Medium (DMEM) | Invitrogen | 11995 | ||
| Phenol red free RPMI or DMEM | Invitrogen | 11835-030 | ||
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 16000-044 | ||
| L-Glutamine (200 mM) | Invitrogen | 25030 | ||
| Penicillin-streptomycin (10000 U/mL) | Invitrogen | 15140 | ||
| Trypsin, 0.05% (1X) with EDTA 4Na, liquid | Invitrogen | 25300 | ||
| HEPES (1M) | Invitrogen | 15630 | ||
| Others: | ||||
| 35 mm sterile glass coverslip-bottomed Fluoro dishes (0.17 mm thick) (WillCo-dish) | WPI | FD35-100 | ||
| Sterile Gene Pulser Cuvette (0.4 cm electrode gap) (Bio-Rad) | Bio-Rad | 16552088 | ||
| Instruments/software: | ||||
| Gene Pulser II electroporater | Bio-Rad | |||
| TE-FM Epi-Fluorescence system attached to Nikon Inverted Microscope Eclipse TE300 | Nikon | |||
| Metamorph Software | Universal Imaging | |||
| Vertical Micro-pipette puller | Narishige International | |||
| Micro-Forge M-900 | Narishige International | |||
| Hadraulic Micromanipulator MO-188NE | Narishige International | |||
| Coarse Manual Manipulator, MN-188NE | Narishige International | |||
| cDNA constructs: | ||||
| cDNA of G-Protein coupled receptor tagged with red fluorescence protein at C-terminus (hBLT1-RFP) | Jala et al 2005 | |||
| cDNA of cytosolic protein tagged with GFP (β-arrestin1-GFP in present study). | Jala et al 2005 |
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