Imagerie en temps réel des leucotriènes B _{4 Cell Mediated et BLT1 Interactions avec β-arrestine}

Récepteurs couplés aux protéines G (RCPG) appartiennent à la famille de sept transmembranaire de protéines et de médiation de la transduction des signaux extracellulaires à des réponses intracellulaires. RCPG de contrôle diverses fonctions biologiques telles que le chimiotactisme, la libération de calcium intracellulaire, la régulation des gènes d'une manière dépendante du ligand via protéines G hétérotrimériques ^1-2. Liaison du ligand induit une série de changements conformationnels conduisant à l'activation des protéines G hétérotrimériques qui modulent les niveaux de seconds messagers tels que l'adénosine monophosphate cyclique (AMPc), inositol triphosphate (IP3) et du glycérol diacyle (DG). Concomitante avec l'activation de la liaison d'un ligand du récepteur initie également une série d'événements afin d'atténuer le récepteur signalisation via la désensibilisation, la séquestration et / ou l'internalisation. Le processus de désensibilisation des RCPG se fait via la phosphorylation du récepteur par des kinases des récepteurs aux protéines G (GRK) et se fixer des β-arrestines ^3. β-arrestines sont des protéines cytosoliques et la translocation de la membrane lors de l'activation de GPCR, la liaison aux récepteurs phosphorylés (la plupart des cas), il en facilitant ^4-6 internalisation du récepteur.

Leucotriènes B ₄ (LTB ₄₎ est une molécule lipidique pro-inflammatoire dérivé de l'acide arachidonique et voie médie ses actions via les RCPG, LTB ₄ récepteurs 1 (BLT1; un récepteur de haute affinité) et LTB ₄ receptor 2 (BLT2; un récepteur à faible affinité ) ^7-9. Le LTB _4-BLT1 voie a été montré pour être critique dans plusieurs maladies inflammatoires, notamment, l'asthme, l'arthrite et l'athérosclérose ^10-17. Le présent document décrit les méthodologies développées pour surveiller _LTB4 induite par la migration des leucocytes et les interactions des β-BLT1 avec arrestine et la translocation des récepteurs dans les cellules vivantes en utilisant des techniques d'imagerie microscopique ^18-19.

La moelle osseuse des cellules dendritiques dérivées des souris C57BL / 6 ont été isolées et cultivées comme décrit précédemment ^20-21. Ces cellules ont été testés en direct des méthodes d'imagerie cellulaire pour démontrer LTB ₄ migration cellulaire induite. Le BLT1 humaine a été marqué avec la protéine fluorescente rouge (BLT1-DP) en C-terminal et β-arrestin1 tagués avec la protéine fluorescente verte (β-arr-GFP) et les plasmides transfectés dans les deux Rat basophiles Leukomia (RBL-2H3) des lignées cellulaires ^18-19. La cinétique de l'interaction entre ces protéines et la localisation ont été surveillés à l'aide en direct vidéo-microscopie cellulaire. Les méthodologies dans le présent document décrit l'utilisation de techniques microscopiques pour étudier les réponses fonctionnelles de G récepteurs couplés aux protéines dans les cellules vivantes. Le présent document décrit également l'utilisation de logiciels Metamorph pour quantifier l'intensité de la fluorescence pour déterminer la cinétique de récepteurs et les interactions entre protéines cytosoliques.