في الوقت الحقيقي التصوير باء Leukotriene 4 الهجرة خلية وساطة BLT1 التفاعلات مع arrestin - β
Summary
وتصف هذه الورقة منهجية لتحديد استجابة الكيميائي من الكريات البيض ليغاندس محددة وتحديد التفاعلات بين مستقبلات سطح الخلية والبروتينات عصاري خلوي باستخدام تقنيات التصوير الخلية الحية.
Abstract
مستقبلات البروتين يقترن G – (GPCRs) تنتمي إلى عائلة البروتينات عبر الغشاء سبعة والتوسط في تنبيغ من خارج الخلية إشارات إلى استجابات الخلايا. GPCRs تحكم في وظائف مختلفة مثل البيولوجي الكيميائي ، جواني الافراج الكالسيوم ، وتنظيم الجينات بطريقة تعتمد يغند عبر heterotrimeric G – البروتينات 1-2. يجند ملزم يؤدي الى سلسلة من التغييرات متعلق بتكوين يؤدي إلى تفعيل heterotrimeric G – البروتينات التي تعدل مستويات الرسل ثانية مثل الأدينوزين الحلقي الأدينوساين (المخيم) ، اينوزيتول ثلاثي الفوسفات (IP3) والجلسرين diacyl (DG). بالتزامن مع تفعيل مستقبلات ملزم يجند يبادر أيضا سلسلة من الأحداث للتخفيف من مستقبلات الإشارات عبر عزل ، الحساسية و / أو الداخلي. عملية إزالة التحسس من GPCRs يحدث عن طريق الفسفرة بواسطة مستقبلات مستقبلات كاينيسات G – البروتين (GRKs) وملزمة لاحقة من arrestins β – 3. β – arrestins هي بروتينات عصاري خلوي ونقل من مكان لآخر لغشاء على تنشيط النوع من الاختزال ، ملزم لمستقبلات فسفرته (معظم الحالات) من خلال تسهيل استيعاب هناك مستقبلات 4-6.
Leukotriene ب 4 (LTB 4) هو جزيء الدهون الموالية للالتهابات مشتقة من حمض الأراكيدونيك المسار ويتوسط أعمالها عبر GPCRs ، LTB 4 مستقبلات 1 (BLT1 ؛ مستقبلة تقارب عالية) ومستقبلات LTB 4 2 (BLT2 ؛ مستقبلة تقارب منخفضة ) 7-9. وقد تبين أن 4 – BLT1 LTB الطريق إلى أن تكون حاسمة في الأمراض الالتهابية عدة من بينها ، والتهاب المفاصل والربو وتصلب الشرايين 10-17. توضح هذه الورقة على المنهجيات الموضوعة لرصد LTB 4 – الكريات البيض بفعل الهجرة وتفاعلات مع BLT1 arrestin – β ، وإزفاء مستقبلات في الخلايا الحية باستخدام تقنيات التصوير المجهري 18-19.
وقد تم عزل خلايا نخاع العظام الجذعية المستمدة من C57BL / 6 و الفئران مثقف كما هو موضح سابقا 20-21. وقد اختبرت هذه الخلايا في خلية حية أساليب التصوير لإثبات LTB 4 خلية بفعل الهجرة. وكان الموسومة BLT1 الإنسان مع بروتين فلوري الأحمر (BLT1 – RFP) في محطة C – β arrestin1 والموسومة مع بروتين الفلورية الخضراء (β – ARR – GFP) وtransfected على حد سواء في البلازميدات الجرذ قعد Leukomia (RBL – 2H3) خطوط الخلية 18-19. وتم رصد حركية التفاعل بين هذه البروتينات والتوطين باستخدام المجهر يعيش الفيديو الخلية. المنهجيات الحالية في ورقة تصف استخدام التقنيات المجهرية للتحقيق في الاستجابات الوظيفية للمستقبلات البروتين G – يقترن في الخلايا الحية. هذه الورقة توضح أيضا استخدام البرمجيات Metamorph لقياس كثافة مضان لتحديد حركية مستقبلات البروتين وتفاعلات عصاري خلوي.
Protocol
Discussion
التصوير الخلية الحية هي أداة قوية للتدليل على وظيفة وتفاعلات بروتينات معينة كما يحدث في الوقت الحقيقي. الطرق الموضحة في هذه المخطوطة تظهر بوضوح أن LTB 4 يمكن أن تحدث الهجرة السريع للخلايا الجذعية. هذه الأساليب ليس فقط توسيع جوانب مهمة 4 LTB لأنواع الخلايا الم…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ويدعم هذا البحث من قبل المعاهد الوطنية للصحة منح AI – 52381 ، CA138623 وكنتاكي أبحاث سرطان الرئة المجلس والدعم المؤسسي من جيمس غراهام مركز السرطان براون.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Cell lines: | ||||
| Rat Basophilic Leukomia Cell line (RBL-2H3) or HEK293 cells. | ATCC | CRL-2256 | ||
| Media: | ||||
| Delbecco’s modified Eagle’s Medium (DMEM) | Invitrogen | 11995 | ||
| Phenol red free RPMI or DMEM | Invitrogen | 11835-030 | ||
| Fetal Bovine Serum | Invitrogen | 16000-044 | ||
| L-Glutamine (200 mM) | Invitrogen | 25030 | ||
| Penicillin-streptomycin (10000 U/mL) | Invitrogen | 15140 | ||
| Trypsin, 0.05% (1X) with EDTA 4Na, liquid | Invitrogen | 25300 | ||
| HEPES (1M) | Invitrogen | 15630 | ||
| Others: | ||||
| 35 mm sterile glass coverslip-bottomed Fluoro dishes (0.17 mm thick) (WillCo-dish) | WPI | FD35-100 | ||
| Sterile Gene Pulser Cuvette (0.4 cm electrode gap) (Bio-Rad) | Bio-Rad | 16552088 | ||
| Instruments/software: | ||||
| Gene Pulser II electroporater | Bio-Rad | |||
| TE-FM Epi-Fluorescence system attached to Nikon Inverted Microscope Eclipse TE300 | Nikon | |||
| Metamorph Software | Universal Imaging | |||
| Vertical Micro-pipette puller | Narishige International | |||
| Micro-Forge M-900 | Narishige International | |||
| Hadraulic Micromanipulator MO-188NE | Narishige International | |||
| Coarse Manual Manipulator, MN-188NE | Narishige International | |||
| cDNA constructs: | ||||
| cDNA of G-Protein coupled receptor tagged with red fluorescence protein at C-terminus (hBLT1-RFP) | Jala et al 2005 | |||
| cDNA of cytosolic protein tagged with GFP (β-arrestin1-GFP in present study). | Jala et al 2005 |
References
- Wess, J. G-protein-coupled receptors: molecular mechanisms involved in receptor activation and selectivity of G-protein recognition. FASEB J. 11, 346-354 (1997).
- Gether, U. Uncovering molecular mechanisms involved in activation of G protein-coupled receptors. Endocr Rev. 21, 90-113 (2000).
- Pierce, K. L., Premont, R. T., Lefkowitz, R. J. Seven-transmembrane receptors. Nat Rev Mol Cell Biol. 3, 639-650 (2002).
- Lefkowitz, R. J. G. protein-coupled receptors. III. New roles for receptor kinases and beta-arrestins in receptor signaling and desensitization. J Biol Chem. 273, 18677-18680 (1998).
- Shenoy, S. K., Lefkowitz, R. J. Multifaceted roles of beta-arrestins in the regulation of seven-membrane-spanning receptor trafficking and signalling. Biochem J. 375, 503-515 (2003).
- . Beta-arrest or. Nature. 383, 447-450 (1996).
- Serhan, C. N., Haeggstrom, J. Z., Leslie, C. C. Lipid mediator networks in cell signaling: update and impact of cytokines. Faseb J. 10, 1147-1158 (1996).
- Tager, A. M., Luster, A. D. BLT1 and BLT2: the leukotriene B(4) receptors. Prostaglandins Leukot Essent Fatty Acids. 69, 123-134 (2003).
- Toda, A., Yokomizo, T., Shimizu, T. Leukotriene B4 receptors. Prostaglandins Other Lipid Mediat. 68-69, 575-585 (2002).
- Haribabu, B. Targeted disruption of the leukotriene B(4) receptor in mice reveals its role in inflammation and platelet-activating factor-induced anaphylaxis. J Exp Med. 192, 433-438 (2000).
- Subbarao, K. Role of leukotriene B4 receptors in the development of atherosclerosis: potential mechanisms. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 24, 369-375 (2004).
- Jala, V. R., Haribabu, B. Leukotrienes and atherosclerosis: new roles for old mediators. Trends Immunol. 25, 315-322 (2004).
- Heller, E. A. Inhibition of atherogenesis in BLT1-deficient mice reveals a role for LTB4 and BLT1 in smooth muscle cell recruitment. Circulation. 112, 578-586 (2005).
- Miyahara, N. Requirement for leukotriene B4 receptor 1 in allergen-induced airway hyperresponsiveness. Am J Respir Crit Care Med. 172, 161-167 (2005).
- Terawaki, K. Absence of leukotriene B4 receptor 1 confers resistance to airway hyperresponsiveness and Th2-type immune responses. J Immunol. 175, 4217-4225 (2005).
- Shao, W. H., Del Prete, A., Bock, C. B., Haribabu, B. Targeted disruption of leukotriene B4 receptors BLT1 and BLT2: a critical role for BLT1 in collagen-induced arthritis in mice. J Immunol. 176, 6254-6261 (2006).
- Kim, N. D., Chou, R. C., Seung, E., Tager, A. M., Luster, A. D. A unique requirement for the leukotriene B4 receptor BLT1 for neutrophil recruitment in inflammatory arthritis. J Exp Med. 203, 829-835 (2006).
- Jala, V. R., Shao, W. H., Haribabu, B. Phosphorylation-independent beta-arrestin translocation and internalization of leukotriene B4 receptors. J Biol Chem. 280, 4880-4887 (2005).
- Jala, V. R., Haribabu, B. Real-time analysis of G protein-coupled receptor signaling in live cells. Methods Mol Biol. 332, 159-165 (2006).
- Del Prete, A., A, . Regulation of dendritic cell migration and adaptive immune response by leukotriene B4 receptors: a role for LTB4 in up-regulation of CCR7 expression and function. Blood. 109, 626-631 (2007).
- Salogni, L. Activin A induces dendritic cell migration through the polarized release of CXC chemokine ligands 12 and 14. Blood. 113, 5848-5856 (2009).
- Boudreau, J., Koshy, S., Cummings, D., Wan, Y. Culture of myeloid dendritic cells from bone marrow precursors. J Vis Exp. , (2008).
