Ein Allel-spezifische Gene Expression Assay zur Funktionsanalyse Grundlage genetischer Verbände testen

1) Cell Culture Wählen Zelltypen Expression des Gens von Interesse. Wählen Zelllinien heterozygot sowohl für die DNA-Risiko-Varianten und transkribiert Codierung Polymorphismus im Gen von Interesse (Abbildung 1). Kultur der ausgewählten Zelllinien nach den Spezifikationen des Lieferanten und für das 2 x 10 cm Petrischalen für die DNA-und RNA-Extraktion bzw.. Wenn die Zellen bis zu 80% Konfluenz starten Sie die Prozedur, um die Ernten Zellen und Isolierung von DNA und RNA entweder nach dem unten beschriebenen Verfahren oder unter Verwendung kommerziell erhältlicher Kits. 2) DNA-Extraktion Entfernen Sie das Medium aus der Schale, mit PBS waschen und hinzufügen, um die Schale 500 ul einer Lyse-Lösung (0,6% SDS, 100 mM NaCl, 50 mM Tris, 20 mM EDTA und 50 pg / mL RNase A). Rock the Platte sanft 20 Minuten bei Raumtemperatur. Kratzen Sie die Zelllysat in ein Mikrozentrifugenröhrchen und bei 37 ° C über Nacht. Add Proteinase K in einer Endkonzentration von 100 ug / ml und bei 37 ° C über Nacht. Extrahieren Sie die DNA mit dem gleichen Volumen Phenol-Chloroform-pH 8, wiederholen, dann mit dem gleichen Volumen Chloroform / Isoamylalkohol extrahiert. Fällung der DNA mit 1 / 10 th Volumen 3 M NaCl und 2,5 Volumen 100% Ethanol. Lassen Sie auf Eis für 5 min und dann Spin bei 13.000 rpm für 30 min bei 4 ° C. Waschen Sie die DNA mit 70% Ethanol, an der Luft trocknen und resuspendieren in 200 ul TE zu ermöglichen. Inkubation bei 65 ° C für 10 min und verlassen dann für 2 Tage bei Raumtemperatur. Lagerung bei 4 ° C oder langfristig bei -20 ° C. 3) RNA-Extraktion Entfernen Sie das Medium aus der Schale, mit PBS waschen, 1 mL TRIzol und Inkubation für 10 min bei Raumtemperatur. Scrape Zellen, Pipette einige Male, Transfer in ein Mikrozentrifugenröhrchen und Inkubation für 5 min. Spin für 10 min bei 10.000 rpm bei 4 ° C. Übertragen Sie den Überstand in ein frisches Röhrchen und mit 200 ul Chloroform. Shake und Spin für 10 min bei 10.000 rpm bei 4 ° C. Übertragen Sie die wässrige Phase in ein frisches Röhrchen und ein gleiches Volumen 70% Ethanol. Laden Sie die Lösung auf 1 oder 2 (je nach Volumen) RNeasy Säule und Spin für 30 sec bei maximaler Geschwindigkeit. Von hier folgen Sie den Anweisungen des RNeasy-Kit (Qiagen). 4) von Nukleinsäuren Quantifizierung der DNA-und RNA-Konzentration mit einem NanoDrop Spektralphotometer (Thermo Scientific). Bereiten from 500-1000 ng der RNA mit zufälligen Dekameren und SuperScript III Reverse Transkriptase (Invitrogen) gemäß den Anweisungen des Herstellers cDNA. 5) PCR und Primer Extension Assay Design zwei Paare von PCR-Primer für jeden DNA-Marker, ein Paar für die genomische DNA-Amplifikation und das andere Paar für cDNA-Amplifikation (Abb. 2). Legen Sie vor-und rückwärts-Primer für cDNA-Amplifikation in verschiedenen Exons, um genomische Kontamination zu vermeiden. Design-Primer ein PCR-Produkt im Bereich von 100-500 bp Länge zu erhalten. Bereiten Sie eine 10 l PCR-Reaktion mit 0,5 U Taq Immolase (Bioline) 0,8 mM dNTPs, 2 mM MgCl 2, 0,2 M jedes Primers und 20 ng entweder cDNA oder DNA. Amplify jede Probe in vier unabhängigen Reaktionen. Führen Sie die PCR-Reaktion unter den Bedingungen für jedes Primerpaar halten Taktzahl in der linearen Phase der Amplifikation optimiert. Nehmen Sie PCR-Primer und dNTPs überschüssige durch Inkubation des PCR-Produkts mit Exonuklease I und Shrimp Alkaline Phosphatase (SAP) bei 37 ° C für 20 Minuten. Spot jedes PCR-Produkt zweimal auf einer 384-Well-Platte, so dass 8 Messungen verfügbar sein wird für jede Probe. Entwerfen Sie die Erweiterung Primer mit dem Assay-Design (Sequenom) Software, so dass die gleichen Primer für beide genomischen und cDNA PCR-Produkte verwendet werden kann. Geben Primer Länge im Bereich von 14-18 bp und Erweiterung Mix einschließlich Kombinationen von 3ddNTPs (Abb. 2). Führen Sie die Primerverlängerungsreaktion und MALDI-TOF/MS Analyse mit dem MassARRAY-System (Sequenom) nach den Anweisungen des Herstellers. Ein typisches Primerverlängerungsreaktion gehören ein Start bei 94 ° C für 2 min, gefolgt von 40 Zyklen von 94 ° C für 5 s, 52 ° C für 5 s und 72 ° C folgte für 5 s. Die Primer-Extension-Produkte sind mit SpectroCLEAN Harz gereinigt und übertragen auf Microarray-(Chip) von SpectroPOINT Nanoliter Dispenser. Die erweiterte Oligonukleotide werden durch MALDI-TOF mit einem SpectroREADER Massenspektrometer quantifiziert. 6) Statistische Analyse Überprüfen Sie MALDI-TOF/MS Ergebnisse mit dem MassARRAY Typer Software für allgemeine Qualität des Experiments. Entpacken Sie die Allelotyping Bericht, der die Peakfläche Daten enthält. Für jedes einzelne Spektrum berechnenVerhältnis zwischen der Peakfläche von Allel 1 und Allel 2 (Peakflächenverhältnis). Für jede cDNA-Probe abzuleiten Peakflächenverhältnis Mittelwert und Standardabweichung, über die entsprechende Funktion in Excel, über die 8 Messungen. Leiten Sie das gleiche bedeuten Peakflächenverhältnis über den 8 Messungen für genomische DNA. Teilen Sie die cDNA mittlere Verhältnis von der genomischen mittlere Verhältnis der Abweichung der erwarteten 1:1-Verhältnis zu bewerten. 7) Experimentelle Kontrollen Um auszuschließen, experimentelle Artefakte, wiederholen Sie das Experiment mindestens dreimal. Wann immer möglich, Design-Assays für weitere DNA-Marker. Entwerfen Sie mehrere PCR-Primerpaare und Erweiterung Primer Annealing sowohl vorwärts als auch rückwärts Stränge. Wann immer möglich Test als Negativ-Kontrollen Zelllinien, die heterozygot für DNA-Marker sind jedoch nicht mit der DNA Risiko-Varianten mit dem Phänotyp assoziiert (Abb. 1 und Abb.. 3) 8) repräsentative Ergebnisse Ein Beispiel für eine Allel-spezifische Expressions-Analyse ist in Abbildung 3 mit Beispielen der Massenspektrometrie Spuren gezeigt. Die Abbildung zeigt die Ergebnisse aus der Analyse von 4-Allel-spezifischen Primer Extension-Produkte auf 4 verschiedene Vorlagen durchgeführt. Die Top-Grafiken stellen die Ergebnisse aus der Analyse der genomischen DNA von zwei verschiedenen Zelllinien, die sowohl heterozygot für eine transkribiert Codierung Polymorphismus erhalten. Allerdings nur Zelllinie A ist heterozygot für das Risiko DNA-Variante (Abbildung 1). Die unteren Diagramme stellen die Ergebnisse aus der Analyse der cDNA aus dem gleichen Zelllinien erzeugt wird. Als Ergebnis der experimentellen Artefakt der erste Gipfel ist immer höher als die zweite Spitze auch in der Genomanalyse. Daher sind die Ergebnisse aus der genomischen Analyse verwendet, um die cDNA Daten zu normalisieren. Nach der Normalisierung ist das Allel-Verhältnis signifikant von 1 in Zell-Linie A (wobei der zweite Peak erscheint niedriger im Vergleich zu den anderen Spektren), während es ist sehr nahe an 1 liegt in Zell-Linie B. Die Daten, die Zell-Linie deuten auf eine trägt eine DNA-Variante, in Phase mit dem Allel durch die zweite Spitze, die die Expression des Gens in der Analyse reduziert gemessen. Zelllinie B bietet eine sehr komfortable negative Kontrolle. Abbildung 1. Zelllinie Auswahl Strategie. Zelllinien A und B sind heterozygot für eine transkribiert Codierung Markierung (Dreieck), sondern nur Zelllinie A ist heterozygot für das Risikomanagement DNA-Variante (Kreis). Die blaue Allel das Risiko-Variante assoziiert ist (entweder mit einem direkten Effekt, oder weil in enger Korrelation mit dem tatsächlichen funktionelle Variante) mit einer niedrigeren Ebene der Transkription. Abbildung 2. Allel-spezifische Primer-Extension-Assay. Diese Zahl zeigt die Work-Flow des experimentellen Verfahrens für beide cDNA (links) und genomischer DNA (rechts) Vorlagen durchgeführt. PCR-Primer (graue Rechtecke) sind entworfen, um eine heterozygote Kodierung Polymorphismus (Dreieck) zu verstärken. Zur Vermeidung von Kontaminationen genomischer PCR-Primer anlagern Sequenzen in verschiedenen Exons (hellblaue Linien), wenn Amplifikation auf cDNA-Template durchgeführt platziert. Das PCR-Produkt wird dann als Vorlage für eine Primer-Extension-Reaktion mit einer Verlängerung Primer durchgeführt verwendet, Glühen eine Basis neben dem Polymorphismus und die geeignete Dosierung von drei Didesoxynukleotid (ddNTPs) Terminatoren (Quadrate) und eine Desoxynukleotid (Kreis) zu verlängern die Grundierung von einem oder zwei Basis bzw.. Die daraus resultierende Primerverlängerungsprodukte haben unterschiedliche Massen, die Trennung und Quantifizierung von MALDI-TOF-Massenspektrometrie ermöglicht. Die Menge des Produkts entsprechend der blauen Allel des DNA-Marker ist relativ niedriger die rote Allel. Abbildung 3. Ergebnisse einer Allel-spezifische Expression Assays. Die Abbildung zeigt die Massenspektrometrie ergibt sich aus der durchgeführten Analyse der genomischen DNA und der cDNA der Zelllinie A-und B-Zelllinie (Abbildung 1).