נוהל לימוד החזרה Footshock-induced של קוקאין מחפשים אצל חולדות מעבדה

1. השיכון התאקלמות בעלי חיים נהלים זכר חולדות לונג אוונס, במשקל 300-325 גרם בזמן ההגעה ביבר, הם שוכנו בנפרד בכלובים מפלסטיק ממוחזר רגיל המכיל מיטה גלולה נייר, עם מכסים רשת תיל כדי להכיל בקבוקי מים ומזון. חולדות מתוחזקים על לוח זמנים אור כהה הפוך (אורות 19:00-07:00), בטמפרטורה, לחות ו שבשליטת ביבר. מזון ומים הם כרצונך המודעה הזמינים כלובי הביתה לאורך הניסוי. חולדות מותר להתאקלם ביבר ותנאי דיור למשך שבוע לפני הניתוח. במהלך תקופה זו חולדות נותרים באין מפריע למעט ניקוי שגרתי, האכלה, ניטור של משקל. 2. צנתור תוך ורידי כירורגיה תחת הרדמה גז isoflurane, ושימוש סטנדרטי טכניקות ניתוחיות aseptic, חולדות מוכנים עם צנתרים silastic בעורק הצוואר הימני. היציאות קטטר לתוך צינורית שונה (פלסטיק אחת) על פני השטח של הגולגולת, ואת הצינורית הוא רכוב על הגולגולת עם ברגים "תכשיטנים מלט שיניים. לפרטים על ניתוחים, ראה 7, 8. בתום הניתוח, צנתרים סמוקות עם כ 0.2 מ"ל של תמיסה המכילה הפרין 50% (1,000 IU) דקסטרוז ו – 50% (25 g/50 מ"ל). חוסם פלסטיק ממוקם על פתיחת צינורית כדי להגן על קטטר מן ההריסות חיצוניים, כדי לשמור patency קטטר. בזמן הניתוח, ושוב ביום לאחר הניתוח, חולדות ניתנות 5 מ"ג / ק"ג, SC, Ketoprofen של משכך כאבים. חולדות מותר לפחות שבעה ימים כדי להתאושש מהניתוח לפני ניסויים. במהלך תקופה זו, חולדות נותרים ללא הפרעה בכלובים הביתה, להוציא את שגרת ניקיון האכלה, ניטור יומיומי של משקל ובריאות כללית. ביום האחרון של תקופת ההחלמה, צנתרים סמוקות עם פתרון הפרין / דקסטרוז (סעיף 2.2) כדי לוודא patency קטטר. 3. נוהלי ההתנהגות הנהלים כל התנהגות מבוצעות באמצעות ציוד שסופק על ידי מד Associates Inc (St Albans, VT). הציוד, שוכנו בחדר ייעודי, כולל ערכה של חדרי אופרנטית רגילה, כל אחד בתוך המתחם קול הפחתת. כל תא אופרנטית מצויד בשני מנופים נשלף, הן גבוהות 6.5 ס"מ מעל רצפת נירוסטה מוט. אור לבן גירוי ממוקם בדיוק מעל ידית אחת, ותגובות על המנוף (מה שנקרא מנוף "פעיל") לגרום התאורה סימולטני של האור לגירוי והפעלה של משאבת אינפוזיה (רזאל מכשירים מדעיים, סנט אלבנס, VT). המשאבה נמצאת על המדף רק מחוץ לחדר אופרנטית, אך בתוך המתחם קול הפחתת. המנוף השני (מה שנקרא מנוף "פעיל") נותר המורחבת בחדר לאורך כל הפרוצדורות, להגיב על מנוף זה ללא תוצאה. לבסוף, כל חדר מצויד כדי לספק זרם קבוע, לסירוגין, footshock שאין מנוס ממנו, חשמלי דרך השלגון לרצפה מוט פלדה. כל תנאי הניסוי (למשל, מצגות גירוי, חליטות בסמים, הלם הלידה), כמו גם נתונים הקלטה איחוד, נעשים דרך ממשקים בין לתאי בדיקה ותפעול של מרכזי המחשב מד Associates תוכנה (MED-IV). הניסוי מתבצע 5 שלבים: 1) הרגלה; 2) קוקאין SA: 3) ללא שימוש בסמים תקופה; 4) הכחדה, ו – 5) בדיקה לצורך החזרתו. בכל שלבי (למעט תקופה ללא שימוש בסמים), חולדות מועברים עבור הפעלות יום מחדר דיור לתאי מבחן אופרנטית. בעלי חיים מועברים בנפרד, בתוך מיכלי פלסטיק קטנים. מזון ומים אינם זמינים בתאי אופרנטית. התרגלות עשרים וארבע שעות שקדמו קוקאין הראשון SA מושב (. ראה סעיף 3.2), החולדות מותר להרגיל לתאי אופרנטית במהלך הפעלת 2-h יחיד; במהלך הפעלה זו את הידית הפעילה חזר בו. קוקאין SA אימונים לפני כל אימון יומי, חולדות הם שקלו בחדר הדיור. לאחר מכן הם מועברים לתאי אופרנטית. לאחר שיוצבו בתאי אופרנטית, מעיין הרכבה צינורות (המשתרעת משאבת עירוי תרופות) מחובר הגולגולת רכוב צינורית. חולדות מותר עצמית לנהל קוקאין HCl במהלך יום 3-h הפעלות, עבור סכום כולל של 8-10 ימים (בין אם ברציפות או עם שני "ימי חופש" להתערב בין הפגישות 5 ו – 6). SA הפעלות לסירוגין בבוקר (9:00-00:00) ואחר הצהריים (13:00-16:00). העיתוי של SA הפעלות הוא לסירוגין כי הנהלים בשלבים הבאים של הניסוי (כלומר הכחדה ובדיקה) להתרחש בשני times של יום עבור כל בעלי החיים (ראה סעיפים 3.4 ו – 3.5), ולכן הסדר זה מונע תופעות של בלבול זמן של יום על התנהגות סמים המבקשים הבאים. כל אימון הוא קדמה תקופה של 5 דקות התאקלמות, שבמהלכה חיות ממוקמים בתאי אופרנטית עם מנוף הפעיל חזר בו. בתחילת האימון, מנוף הפעיל המורחבת לתוך תא והאור גירוי (הממוקם מעל הידית פעיל) מואר במשך 30 s. בנוסף, לאור בית מופעלת בשלב זה, ונשאר מואר במהלך הפגישה. יחד, אירועים אלה אות הזמינות של קוקאין. במהלך הפגישה, התגובות על המנוף פעיל מחוזקים על ידי עירוי 3-s של קוקאין (0.23 mg/65 μL, ד) על לוח זמנים קבוע יחס של 1-חיזוק. בד בבד עם הפעלת המשאבה עירוי משלוח סמים היא הפעלה 20-s האור הגירוי מנוף מעל הפעיל. זו מצגת 20-s אור מקבילה תקופה "פסק זמן" במהלכו נוספים התגובות מנוף פעיל נרשמות אך לא מחוזק. בעלי חיים מותר מקסימום של 50 חליטות בכל הפעלה של 3 שעות. אנו שגרתי להטיל את הקריטריון הזה בעבודה שלנו, הניסיון שלנו, מצאו כי הוא מפחית בצורה ניכרת, אם לא מבטל, מקרים של מוות כתוצאה ממנת יתר. בסוף כל מפגש יומי, צנתרים החולדות הן סמוקות עם 0.2-0.3 מ"ל של תמיסת הפרין, דקסטרוז (ראה סעיף 2.2) לבין חולדות מוחזרים כלוב ביתם. תרופות ללא תקופת לאחר הפגישה האחרונה קוקאין SA, חולדות נותרים באין מפריע (למעט ניקוי שגרתי, האכלה, ניטור של משקל) בכלוב בביתם מינימום של שבעה ימים. הכחדה של התנהגות קוקאין מאומן חולדות מועברים לתאי אופרנטית בין 9:00-10:00 לאימונים הכחדה. באביב הרכבה צינורות מחובר הגולגולת רכוב צינורית. בהתאם לתנאי לאימונים SA, כל יום של אימון הכחדה היא קדמה תקופה של 5 דקות התאקלמות, שבמהלכה חיות ממוקמים בתאי אופרנטית עם מנוף הפעיל חזר בו. חולדות מקבלים מכן ארבעה 60 דקות הפעלות הכחדה, מופרדות 30 דקות במרווחים. כל מפגש 60 דקות הוא שיזם את האירועים באותו להתרחש בתחילת האימונים (כלומר, תאורה של אור את הבית, הרחבה של המנוף פעילה, 30 שניות תאורה של אור הגירוי מנוף מעל הפעיל). במהלך הפגישות, כל התנאים שהיו קיימים במהלך אימון SA נשמרים (כלומר, התגובה תלויות תאורה של אור גירוי במשך 20 שניות ו 3-s הפעלת המשאבה עירוי), חוץ מזה התגובות מנוף פעיל מתחזקים כבר לא עם חליטות קוקאין . במשך 30 דקות במרווחים המפרידים כל מושב 60 דקות הכחדה, מנוף הפעיל חזר והאור בבית כבה. בסוף הפגישה 60 דקות האחרונות, חולדות מוחזרים כלוב ביתם. צעדים 3.4.1. ל 3.4.5. חוזרים על עצמם במשך 3 ימים רצופים. החזרה של התנהגות קוקאין מאומנים על ידי מתח footshock חולדות מועברים לתאי אופרנטית בין 9:00-10:00 לאחר שיוצבו בתאי אופרנטית, באביב הרכבה צינורות מחובר הגולגולת רכוב צינורית. בהתאם לתנאי לאימונים הכחדה, לתקופה של 5 דקות התאקלמות מסופק, שבמהלכה חולדות ממוקמים בתאי אופרנטית עם מנוף הפעיל חזר בו. חולדות מקבלים מכן שני מפגשים של 60 דקות הכחדה (ראה 3.4.4). מופרדים על ידי מרווח של 30 דקות, זהים לאלה שניתן בשלב הכחדה. אם לאחר הפגישה 60 דקות השני המספר הכולל של התשובות על מנוף הפעיל בעבר הוא פחות מ 15, בעלי חיים מקבלים מבחן השבה לאחר הפסקה של 30 דקות נוספות. בהפסקה של 30 דקות זו, footshock או אחיזת עיניים footshock (כלומר, לא footshock) מנוהלת (ראה 3.5.6).. אם הקריטריון של 15 או פחות תגובות על מנוף הפעיל אינה מושגת לאחר הפגישה השניה, מושב הכחדה נוסף (ים) ניתנת לפני בדיקות לצורך החזרתו. עשר דקות אחרי הפגישה 60 דקות second הכחדה (או לאחר כל מפגש 60 דקות נוספות הכחדה (ים) נדרש לקבוע את הקריטריון, הכחדה של 15 או פחות תגובות), בעלי חיים חשופים 20 דקות של מתח לסירוגין footshock חשמלי (או אחיזת עיניים footshock) בחדר אופרנטית. Footshock ניתנת בתקופה כאשר הפעיל את הידית חזר ואורות הבית גירוי הם כבויים. Footshock מועבר על פי לוח זמנים זמן משתנה במרווח ממוצע של 40 שניות (טווח של 1-70). הלם כל מועבר בעוצמה של 0.9 mA, והוא 0.5 של משך. פרמטרים אלה של footshock מבוססים על עבודה פיילוט נרחבבוצע במעבדה שלנו להקים השבה אמין של קוקאין המבקשים, בעוצמה משך מינימום של חשיפה footshock. על פי הפרמטרים האלה, חיות התערוכה תגובה רפלקסיבית קפיצה אל ההלם של 0.5, ומדי פעם לפלוט הניקוד קצר. למרות החיות הם נצפו לאורך תקופת ההלם, את עוצמת הזעזוע אינו בסדר גודל מספיק כדי לגרום סימנים בולטים יותר של מצוקה. מיד לאחר סיום הפגישה footshock, הפעיל את הידית מוארך וחולדות מותר מנוף לחץ בתנאים הכחדה (כלומר, התגובות אינן חיזק עם קוקאין, אבל האם להמשיך לגרום תאורה של אור גירוי והפעלה של משאבת עירוי ). פרק זמן זה מוגדר לבדוק את להחזרת הוא בדרך כלל 1-3 שעות משך. רוב להגיב מתרחשת בחלקה הראשון של הפגישה המבחן (הראשון 30 דקות h-1), ולאחר מכן מכבה לאורך תקופות הבדיקה המורחבת יותר. לפיכך, מבחן 1 שעות מספיקה כדי ללכוד את האפקט השבה, עם תקופות מבחן ארוך מתן פרופיל הכחדה מלאה יותר של ההשפעה. כאשר העיצוב אמצעים חזר הוא מועסק, חולדה כל נבדק בתנאים footshock ואת דמה footshock. צעדים 3.5.1. ל 3.5.8 חוזרים ביום הבדיקה שלאחר מכן, ואת מבחן חלופי השבה (footshock או אחיזת עיניים footshock) מנוהל. 4. נציג תוצאות: באיור 1. פרופילים מסוגנן בתגובה לפעילות על מנופים פעיל פעיל במהלך האימון מינהל עצמי, הכחדה, ובדיקה השבה. איור 1 מציג מסוגנן פרופילים תגובה אופרנטית, אופייני לאלה שהושגו במהלך השלבים השונים של פרוטוקול הניסוי המתואר להלן. 1. מנוף התגובות פעילים קוקאין הכשרה SA. איור 1 (פאנל משמאל) מראה קוקאין טיפוסי SA הכשרה עקומת הכולל הן מספר חליטות והמספר הכולל של בתי מנוף פעיל. חולדות בדרך כלל לרכוש קוקאין SA בתוך 1-3 מפגשים, ופעם אחת את ההתנהגות היא הוקמה, לשמור על קצב יציב של צריכת סמים (בדרך כלל פחות מ -20% מהשונות בין-session) על ההפעלות שלאחר מכן. הכחדה של התנהגות קוקאין מאומן. ניתן לראות באיור 1 (פאנל באמצע), כי ביום 1 הכחדה, כאשר התגובות הן לא חיזק בפעם הראשונה, המספר הכולל של התשובות על הידית הפעילה בתחילה גבוה יותר מאשר ב סיום שלב ההכשרה (המקביל ל "פרץ הכחדה" מה שנקרא); בהדרגה, על פני ארבעה מפגשים הכחדה, להגיב פוחתת. בימים 2 ו -3 של הכחדה, התאוששות מסוימת של מגיבים (יחסית לזה שנצפה במהלך הפגישה האחרונה של היום הקודם) אפשר לראות, עם זאת, התגובות הן בדרך כלל פחות מאשר בתחילתו של היום הקודם הכחדה, ו הכחדה כלל ההכנסות בקצב מהיר יותר במהלך ארבעת הפגישות לאותו יום. החזרה של קוקאין המבקשים. ניתן לראות באיור 1 (פאנל מימין) כי 20 דקות של חשיפה footshock לסירוגין גורם לעלייה שאינם מחוזקים להגיב על המנוף פעיל, יחסית לזה שנצפה בסוף הפגישה הקודמת הכחדה. Footshock גם גורם לעלייה להגיב יחסית לזה שנצפה בתנאים שבהם דמה footshock מנוהל. לפיכך, השבה של קוקאין על ידי המבקשים להדגיש footshock ניתן לבטא גם כ: 1) מספר גדל של אי מחוזק התגובות לאחר חשיפה footshock, יחסית לתגובות בפגישה לפני הכחדה footshock או 2) את מספר גדל של אי – חיזוק תגובות לאחר יחסי footshock כדי footshock דמה. 2. מנוף התגובות פעילה ניתן לראות באיור 1 (הקו האדום), כי לאורך כל שלבי הניסוי, יש רמות נמוכות מאוד בתגובה הקשורים המנוף פעיל. עם זאת, עלייה מתונה להגיב על המנוף הזה הוא ציין לפעמים חשיפה הבאים להדגיש footshock. גם במקרים בהם כגון עלייה להגיב מתרחשת, גידול המנוף פעיל להגיב נוטה להיות הרבה יותר באופן יחסי.