Alterações na morfologia da glândula mamária e risco de câncer de mama em ratos

1. A remoção da glândula mamária e abdominal Preparando um monte inteiro Eutanásia do animal de acordo com as diretrizes IACUC. Pin o animal à sua volta de suas pernas com agulhas, ou fita as pernas em cima da prancha de superfície, e limpe a pele molhada com etanol (EtOH). Levante a pele um pouco com uma pinça e com tesoura afiada fazer uma incisão mediana na pele de partida entre os dois mamilos # 5 e cortou para o pescoço. Faça uma incisão Y invertido a partir da linha média para as pernas traseiras. Se torácica glândulas mamárias também estão a ser recolhidos, fazer também uma incisão Y da linha média entre o par # 2 mamilos para as pernas da frente. Dissecar a pele com uma tesoura aberta em um lado da incisão Y invertido para expor a glândula abdominal # 4 mamária; as glândulas mamárias estão ligados à pele. Pinos na pele com agulhas na placa de superfície, para exposição da glândula. Trabalho de um lado e da glândula no momento. Dissecar a glândula mamária livre da pele ou usando uma tesoura afiada e / ou um bisturi, a partir da área proximal perto do mamilo e trabalhar no sentido da extremidade distal da glândula em direção a espinha dorsal do animal. (Isto pode demorar vários minutos, especialmente em um velho rato.) Imediatamente espalhou a glândula destacada em uma lâmina de vidro devidamente rotulados (use uma caneta apropriada permanente e / ou "uma caneta de diamante"), e espalhe cuidadosamente a glândula correspondente ao seu tamanho original e forma in situ. A lâmina de vidro deve ser maior do que a glândula. Depois de espalhar a glândula para o slide, deixe-o sentar na mesa por um tempo, para que a glândula varas para o slide, mas não deixe secar. Coloque o slide em um frasco contendo fixador de Carnoy (75% de ácido acético glacial, 25% etanol absoluto = EtOH), permita que ela se fixa à temperatura ambiente (RT) na capela de dois dias ou mais. Slides também podem ser deixadas no fixador por um longo período de tempo. Lavar as lâminas em EtOH 70% por 1 hora em temperatura ambiente. Enxágüe em água destilada por 30 min em temperatura ambiente. Mancha em Alum Carmine mancha *) para 2 dias ou mais (até ver que os gânglios linfáticos têm manchado através; olhar para o lado de trás do slide). Lavar em série crescente de etanol, 1 hora em cada um: 70% -> 95% -> 100%. Após a última lavagem em termos absolutos EtOH colocar as glândulas em xileno. Vamos sentar-se na capela da TR pelo menos por dois dias. Este último passo é limpar da glândula mamária delipidation significado do pad mamárias gordura, e subsequente aumento da transparência. O fattier da glândula é o mais longo tempo de compensação é necessária. Monte com cobertura desliza usando uma mídia de montagem, como Permount. Deixe secar bem os slides (vários dias) antes de observar em um microscópio estéreo. * Alum Carmine Stain: Colocar 1 g de carmim (Sigma C1022) e 2,5 g de sulfato de potássio alumínio (Sigma A7167) em 500 mL de água destilada e ferver durante 20 min. Ajustar o volume final de 500 mL com água. Filtrar e refrigerar. Solução pode ser usada por vários meses. Descartar quando a cor se torna fraco. 2. Análise da morfologia mamária Monte Gland Whole Glândula mamária toda morfologia monta é analisado de acordo com os seguintes pontos finais e os resultados correlacionados com o risco de câncer mamário. Glândula mamária toda montagem de PND 21 (pré-púberes idade): Crescimento epitelial: Distância do mamilo até o fim da árvore epiteliais (em milímetros), medida com uma régua Potencial de transformação maligna: Número de TEBS (brotos fim terminal), contados em microscópio de luz. TEBS são as maiores estruturas bulbosa localizado apenas na extremidade distal da árvore mamárias epiteliais Diferenciação: AB1 pontuação (alveolar bud) (0-5). Buds alveolares são espalhados por todo o epitélio. AB2 pontuação (0-5) Monta conjuntos são marcados com um microscópio de luz. Os valores de pontuação de AB1 e AB2 são adicionadas para uma pontuação diferenciação final. Glândula mamária todo-mount coletados no PND 50 (pós-púberes idade): Crescimento epitelial: Distância do nó de linfa até o fim da árvore epiteliais (em milímetros), medida usando uma régua. Distância da ponta da árvore epiteliais para o fim da gordura abdominal, medida usando uma régua. Potencial de transformação maligna: Número de TEBS, contados em microscópio de luz Diferenciação: AB1 pontuação (0-5) AB2 pontuação (0-5) Lóbulos pontuação (0-5) Monta conjuntos são marcados com um microscópio de luz. Diferenciação será avalia de duas maneiras. Primeiro, os valores de pontuação AB1, AB2 e lóbulos são adicionadas para uma pontuação diferenciação final. Além disso, a relação entre lóbulos pontuação e + AB1 AB2 pontuação será calculada. ABs para diferenciar lóbulos, e quanto maior a taxa entre os lóbulos e ABS, o mais diferenciado da glândula é. 3. Palpação e medição do tumor mamário em ratos e Correlação de Morfologia da glândula mamária Para iniciar este procedimento, segure o rato, segurando todo o corpo com a palma da mão sobre as costas, com o indicador por trás da cabeça eo polegar eo segundo dedo sob a axila oposta. Ligue o rato para que ele esteja mentindo sobre o seu posterior, e apalpar para detectar tumores mamários; tumores palpáveis ​​deve se sentir como um "caroço". Em seguida use um paquímetro para medir a largura, comprimento e altura do tumor. Calcular o volume tumoral utilizando a fórmula de elipsóide Volume, = 1/6πabc, onde 'a' = largura, comprimento 'b' = e 'c' height =. Registrar manualmente a localização eo tamanho do tumor em um notebook em uma base semanal. Estes dados serão transferidos para uma planilha mais tarde. 4. Resultados representante Dissecção cuidadosa da almofada mamárias gordura e seu processamento para wholemount vai permitir a avaliação do estado de desenvolvimento da glândula mamária. Quando cada passo é feito corretamente, a árvore inteira epiteliais mamárias é claramente visível dentro do bloco de gordura, e isto permite a determinação fácil de o número de TEBS e cálculo da densidade de brotos alveolar e lóbulos. Erros em wholemounts preparando podem incluir a falha de dissecar o bloco inteiro de gordura, fixação insuficiente, inadequada e limpeza. Avaliação da morfologia da glândula mamária irá fornecer informações sobre o número das actuais estruturas que podem dar origem a tumores mamários (TEBS), grau de diferenciação das estruturas epiteliais (brotos alveolar e lóbulos), ea medida do crescimento (alongamento ductal). É importante separar TEBS para fins terminal, este último estão localizados na extremidade distal do epitélio, à semelhança do TEBS, mas eles são menores do que TEBS e não dar origem a tumores malignos. Termina terminal também são vistos dentro da árvore epiteliais. Figura 1:. Resultado Representante do bem preparado montar toda glândula mamária Todos os componentes da glândula foram devidamente dissecados e coloração carmim é o ideal. Figura 2:. Representante resultado de uma montagem de todo mal preparados glândula mamária A glândula foi devidamente dissecado (a porção distal da glândula em falta), não foi devidamente esticada e delipidation não foi completamente ocorreu.