Imágenes in vivo de larvas de Drosophila intactos a nivel sub-celular Resolución

A) Asamblea de la cámara de imágenes Seleccione una larva de la etapa elegida (por ejemplo, principios de 3 º estadio las larvas dejando un intervalo de la observación de unas 24 horas a 25 ° C hasta vagando etapa). Enjuague la larva con agua para limpiar el medio de cultivo y el lenguado que se seque. Cubrir el centro del elemento de fondo de la cámara, de la región para hacer frente a la larva, con una fina película de aceite de halocarbonos. Ponga la larva con la parte ventral hacia el objetivo del microscopio en la cámara (que permite la unión neuromuscular (UNM) 26 y 27 a ser reflejados) (Figura 1 AE). Coloque el separador de plástico en la capa de aceite, con las ranuras de ventilación de la parrilla hacia arriba la cara (Figura 1 A). Por favor, verifique en este paso: La altura del espaciador es aproximadamente la mitad del diámetro de las larvas, el ancho de la ranura debe ser aproximadamente el doble del diámetro de la larva. Coloque la cámara de imágenes en el microscopio B) estetización de la larva Conecte las dos entradas de la cámara con una anestesia adecuada de dispositivos / vaporizador. Por favor, verifique por adelantado: La concentración efectiva de desflurano en el aire ambiente no debe exceder de lo especificado por las normas de seguridad! Sólo un volumen total muy pequeño de desflurano es necesaria para anestesiar a las larvas. La aplicación del 15% (v / v) de desflurano 1 ha demostrado ser un buen punto de partida para determinar la concentración ideal para ser utilizado en un experimento. Por razones de seguridad sugieren que el vaporizador no debe contener más de lo necesario desflurano durante 2-4 horas de imágenes in vivo. Sumerja el otro extremo del tubo que va conectado a la salida de la cámara en un vaso de agua a continuación, abra las válvulas que controlan el flujo de la anestesia en la cámara durante unos cinco segundos. Por favor, verifique en este paso: Hacer las burbujas de aire ascienden en el agua? Si no es la cámara de fugas. Cerrar las válvulas durante unos tres segundos. Vigilar los movimientos residual de larvas en el microscopio. Comprobar tanto los latidos del corazón y los movimientos musculares. Si es necesario abrir y cerrar válvulas como se describe en el paso 8 y 9 hasta anestesia de la larva se ha completado, a continuación, cierre todas las válvulas y empezar de imágenes. Por favor, verifique en este paso: El movimiento muscular residual o latidos del corazón indica que la larva no está bien anestesiado. Anestesia completa es vital para las imágenes de alta resolución. La larva no deberá ser anestesiado durante más de 15-20 minutos en un momento dado. C) Imagen Identificar la posición correcta y la imagen de la estructura de interés (Figura 4.2). D) La recuperación de la anestesia Después de la filmación se completó permitir que el aire en la cámara. Por favor, verifique en este paso: Comprobar las contracciones del músculo cardíaco y de la larva con luz halógena de transmisión. Como los músculos comienzan contratación es seguro para eliminar la larva de la cámara de imágenes. Desconecte la cámara del dispositivo de anestesia y sacarlo de un microscopio. Desmonte la cámara con cuidado y coloque la larva en el medio de cultivo de puré de volar. Guarde el plato en una incubadora a la temperatura adecuada. E) de series de tiempo Repita los pasos hasta que el 14.2 puntos suficientes de tiempo se han obtenido. Alternativa protocolo: Si la larva es formar una imagen más de una vez dentro de un intervalo de 30 minutos podría ser práctico para dejarlo en la cámara de imagen hasta el punto de anestesia la próxima vez. Repita los pasos hasta que el 14.7 puntos suficientes de tiempo se han obtenido. Por favor, verifique en este paso: La larva no se almacenará en la cámara de imágenes por más de dos horas a la vez, ni es para ser anestesiados por más de 15-20 minutos a la vez. Figura 1 de la Asamblea de la cámara de imágenes. (A) Colocar la larva y el separador de plástico en la capa de aceite. (B) Colocar un 22 x 22 mm cubreobjetos en el separador y se inserta el anillo guía de plexiglas en la cámara, al lado de (C) fijar la posición de la larva con el anillo de metal y (D) cerca de la cámara. (E) Ahora la cámara está lista para ser montada en el microscopio. Figura 2 de la pared del cuerpo-los músculos de las larvas de Drosophila. Músculos y NMJs se visualizaron mediante la expresión de una proteína de fusión CD8-GFP-Sh 8. Los músculos se muestran tal como se observa cuando se enfoca en la parte ventral a través de la cutícula en la larva. En (AC) el músculo más superficial, de 27 años, se muestra en (KL) la mayoría de los músculos interiores, 6 y 7, se muestran. Barra de escala: 100 micras, ΔZ entre cortes es de 2 micras. Figura 3 Identificación de los músculos de la pared del cuerpo en larvas de Drosophila. La identidad de los músculos en L3 larvas de Drosophila, A3 segmento, se muestra. Músculos y NMJs se visualizaron mediante la expresión de una proteína de fusión CD8-GFP-Sh 8. Los músculos se muestran tal como se observa cuando se enfoca en la parte ventral a través de la cutícula en las larvas. En AC el músculo más superficial, de 27 años, se muestra, en Kuala Lumpur los músculos más interior, 6 y 7, se muestran. Barra de escala: 100 m, ΔZ entre cortes es de 2 micras. Figura 4 La identidad de la unión neuromuscular de larvas de Drosophila. (AD) NMJs se visualizaron mediante la expresión de una proteína de fusión mRFP DGluRIIA-1. El NMJs se muestran tal como se observa cuando se enfoca en la parte ventral a través de la cutícula en la larva. En (AB), el más superficial MNJ, de 27 años, se muestra, en el CD NMJs más interior, 6 y 7, se muestran. Barra de escala: 100 m, ΔZ entre cortes es de 5 micras. (E) y (F) la identidad de la superficial (E) y el interior más (F) NMJs se da como referencia.