서브 세포 해상도 손상 Drosophila의 애벌레의 생체내 이미징에서
Summary
이 프로토콜은 그대로의 anesthetization 및 이미징을위한 신뢰할 수있는 방법을 설명합니다<em> Drosophila melanogaster</em> 애벌레. 우리는 desflurane 휘발성 마취가 몇 일 이내에 대한 구조의 하위 세포 해상도와 다시 인식에서 반복 이미징 수 있도록 활용해야<sup> 1</sup>.
Abstract
원하는 유전자 변형 동물 라인의 효율적인 설립을 허용 광학 이미징, 유전자 인코딩 fluorophores과 유전 도구에 최근 개선은 생물 학적 과정은 생활의 맥락에서 연구되고 활성화하고, 어떤 경우에는 심지어, 유기체 행동했습니다. 이 프로토콜에서는 하위 세포 해상도 1-3에서 시냅스 인구의 개발과 소성에 따라 desflurane 휘발성 마취제를 사용하여 손상 Drosophila의 애벌레를 마취하는 방법을 설명합니다. Drosophila melanogaster의 애벌레를 마취 다른 유용한 방법은 이전에 4,5,6,7,8를 설명했습니다 있지만, 여기에 표시되는 프로토콜은 다음과 같은 조합 주요 기능으로 인해 상당한 개선을 보여줍니다 anesthetization (1) 매우 높은 학위를,도 심장 박동은 일 2 (몇 시간의 기간 동안 개 이상의 시간 점의 녹음을 허락 anesthetization 사이클 당> 90 % (2) 높은 생존율, 최대 150 nm의 1 수평 해상도에 대한 허용 체포 3)이 경우에 우리를 가능하게 높은 민감도는 생리적 수준에서 표현 단백질의 역학을 연구합니다. 세부, 우리는 GluR – IIA 안정 트렌스 제닉 라인에서 내생 모터 1 엑슨 트랩 라인 FasII – GFP 하나를 통해 표현 postsynaptic 글루 탐 산염 수용체 subunit을 시각화 수 있었다. (4) 다른 방법과는 달리 4,7 애벌레가 아니라 살아있는 몇 군데 아니라 손상 수 있습니다 (즉, 비 해부) 관찰은 일 1 숫자를 통해 발생하는 수. 함께 비디오 내용을 생체내 이미징 챔버 2,3에있는 개별 부품의 기능, 애벌레, anesthetization 절차, 방법 유충 내의 특정 위치를 다시 확인하고 애벌레의 안전한 제거 장착 올바른 이미징에서 챔버.
Protocol
Discussion
제출 방법은 처음 Drosophila melanogaster의 애벌레의 본문 벽의 근육에 glutamatergic 시냅스를 공부하기 위해 개발되었습니다. Drosophila 신경근육학 교차로 (NMJ)은 근육과 신경의 틀에 박힌 cyto 아키텍처가 특징이며, 따라서 이상적인 생체내 이미징에 적합합니다. 그러나, 설명 anesthetization 프로토콜은 이미징 NMJ에 국한되지, Drosophila의 애벌레의 투명성은 장기의 개발 연구를 설명하는 프로토콜의 적응, 세포의 마이 그 레이션, 세포 내에서 axonal화물과 하위 세포 조직 개편의 수송을 용이하게합니다.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 안드레아스 Schönle, Biophysical 화학, 독일, 데이비드 J. 샌드 스트롬, 정신 건강의 국립 연구소, 기술적인 조언 건강, 베데스다, MD, 미국의 국립 연구소에 대한 최대 – 플랭크 – 연구소 주셔서 감사합니다. 우리는 프랭크 Kötting, 유럽 신경 과학 연구소, 이미징 챔버 구축을위한 괴팅겐과 anesthetization 장치를 주셔서 감사합니다. 이 작업이 TMRYZ에 알츠하이머 Forschung 이니셔티브에서 교부금에 의해 지원되었고 세포 및 분자 신경 과학, 튀빙겐 대학교에 대한 대학원의 화목에 의해 중국 장학 협의회, SBH의 화목에 의해 지원되었다.
Materials
Reagents:
- Desflurane (Suprane, Baxter, Unterschleißheim, Germany)
- Halocarbon oil (e.g. Voltalef H10S oil / Atofina, Puteaux, France)
- Fly culture medium
Equipment:
- Inverted confocal microscope
- Binocular microscope (e.g. Stemi 2000, Carl Zeiss, Jena, Germany)
- Small paintbrush as used to sort flies
- Incubator
- Custom built imaging chamber (For mechanical drawings see Ref. 3)
- Vaporizer/anesthetization device (For details see Ref. 3)
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