Enzyme-linked immunospot Assay (ELISPOT): Quantificação de Th-1 respostas imunes celulares contra antígenos microbianos
Summary
Identificação de alvos microbiana da imunidade adaptativa em doenças idiopática pode ser realizado através da utilização do ensaio immunospot enzyme-linked.
Abstract
Imunidade adaptativa é um componente importante para eliminação de patógenos intracelulares. A capacidade de detectar e quantificar essas respostas em seres humanos é uma importante ferramenta de diagnóstico. O ensaio de enzyme-linked immunospot (ELISPOT) está ganhando popularidade por sua capacidade de identificar respostas imunes celulares contra antígenos microbianos, incluindo populações imunossuprimidos, como aqueles com infecção pelo HIV, transplante e uso de esteróides. Este ensaio tem a capacidade de quantificar as respostas imunes contra antígenos microbianos específicos, bem como distinguir se estas respostas são Th1 ou Th2 em caráter. ELISPOT não se limita ao local da inflamação. É versátil na sua capacidade para avaliar a resposta imune no sangue periférico, bem como sites de envolvimento ativo, como lavado broncoalveolar, líquor cerebral, e ascite. Detecção de resposta imunológica contra um antígeno único ou múltiplo é possível, bem como epitopos específicos dentro de proteínas microbianas. Este ensaio facilita a detecção das respostas imunes ao longo do tempo, assim como distinções na antígenos reconhecidos pelas células T host. Ensaios de ELISPOT dupla de cores estão disponíveis para a detecção de expressão simultânea de duas citocinas. Aplicações recentes para esta técnica incluem o diagnóstico de tuberculose extrapulmonar, bem como a investigação da contribuição de antígenos infecciosos de doenças auto-imunes.
Protocol
Discussion
O ensaio de ELISPOT tem emergido como um dos ensaios mais importantes e amplamente utilizados para monitorar as respostas imunes em humanos e uma variedade de outras espécies. Com o ensaio ELISPOT, as freqüências de células imunes podem ser medidos no nível da célula única, sem expansão ou a manipulação de populações de células. ELISPOT tem sido amplamente aplicado para investigar antígeno específico respostas imunes em várias doenças, incluindo infecções, câncer, alergias e doenças auto-imunes. A a…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Apoiado em parte pela Vanderbilt CTSA conceder um UL1 RR024975 do Centro Nacional de Pesquisa de Recursos, National Institutes of Health. Este trabalho foi financiado pelo NIH R01 HL 83839; R01 AI 65744.
Materials
A. Preparation of Media
B. Preparation of Tris Buffer
- Add 800 ml of ddH2O to 1 L beaker.
- Measure 12 grams of Tris and add to the beaker.
- Add 0.12 grams of magnesium chloride hexahydrate (MgCl2:6H2O) into the beaker.
- Stir with magnetic stirring rod on automatic stirring plate.
- Once dissolved, pH the solution to 9.5.
- Add 200 mL of ddH2O to the beaker, bringing it up to 1000mL.
- Filter the solution with a 0.22 μm filter.
C. Materials necessary for ELISPOT analysis:
References
- Dosanjh, D. P., Hinks, T. S., Innes, J. A., Deeks, J. J., Pasvol, G., Hackforth, S., Varia, H., Millington, K. A., Gunatheesan, R., Guyot-Revol, V., Lalvani, A. Improved diagnostic evaluation of suspected tuberculosis. Ann Intern Med. 148, 325-336 (2008).
- Sung, H. K. E. Diagnosis of abdominal tuberculosis by T-cell based assays on peripheral blood and peritoneal fluid mononuclear cells. Journal of Infection. 59, 409-415 (2009).
- Kim, S. -. H. Diagnosis of Central Nervous System Tuberculosis by T-Cell-Based Assays on Peripheral Blood and Cerebrospinal Fluid Mononuclear Cells. Clinical and Vaccine Immunology. , 1356-1362 (2008).
- Drake, W. P., Dhason, M. S., Nadaf, M., Shepherd, B. E., Vadivelu, S., Hajizadeh, R., Newman, L. S., Kalams, S. A. Cellular recognition of Mycobacterium tuberculosis ESAT-6 and KatG peptides in systemic sarcoidosis. Infect Immun. 75, 527-530 (2007).
- Allen, S. S., Evans, W., Carlisle, J., Hajizadeh, R., Nadaf, M., Shepherd, B. E., Pride, D. T., Johnson, J. E., Drake, W. P. Superoxide dismutase A antigens derived from molecular analysis of sarcoidosis granulomas elicit systemic Th-1 immune responses. Respir Res. 25, 36-36 (2008).
- Mutsvangwa, J., Millington, K. A., Chaka, K., Mavhudzi, T., Cheung, Y. B., Mason, P. R., Butterworth, A. E., Corbett, E. L., Lalvani, A. Identifying recent Mycobacterium tuberculosis transmission in the setting of high HIV and TB burden. Thorax. 65, 315-320 (2010).
- Streeck, H., Frahm, N., Walker, B. D. The role of IFN-gamma Elispot assay in HIV vaccine research. Nat Protoc. 4, 461-469 (2009).
- Chaudhary, N., Staab, J. F., Marr, K. A. Healthy human T-Cell Responses to Aspergillus fumigatus antigens. PLoS One. 5, e9036-e9036 (2010).
- Manigold, T., Mori, A., Graumann, R., Llop, E., Simon, V., Ferr, S. M., Valdivieso, F., Castillo, C., Hjelle, B., Vial, P. Highly differentiated, resting gn-specific memory CD8+ T cells persist years after infection by andes hantavirus. PLoS Pathog. 6, e1000779-e1000779 (2010).
- Ndongala, M. L., Kamya, P., Boulet, S., Peretz, Y., Rouleau, D., Tremblay, C., Leblanc, R., Côté, P., Baril, J. G., Thomas, R., Vézina, S., Boulassel, M. R., Routy, J. P., Sékaly, R. P., Bernard, N. F. Changes in function of HIV-specific T-cell responses with increasing time from infection. Viral Immunol. 2, 159-168 (2010).
