이온 채널의 돌연변이 유발과 기능 분석 Heterologously 포유 동물 세포에 표현

1. 사이트 돌연변이 유발을 감독 우리는 GIRK2에 대한 포유 동물 표현 플라스미드 pcDNA3.1 인코딩에게 cDNA를 사용하여 제조 업체의 지시에 따라, Stratagene (애질런트 테크놀) Quikchange XL II 사이트 – 감독 돌연변이 유발 키트를 사용하여 점 돌연변를 소개합니다. Primers 순서 쉽게보실 수 온라인 프라이머 디자인 프로그램을 사용하여 생성할 수 있습니다 : https://www.genomics.agilent.com/CollectionSubpage.aspx?PageType=Tool&SubPageType=ToolQCPD&PageID=15 참고 : 우리는 프로토콜에 설명된 BD 14 ML 튜브 대신에 표준 Eppendorf 1.5 ML 튜브를 사용합니다. 하지만, XL10 – 골드 ultracompetent E.의 사용 β – 메르 캅 토 에탄올과 pretreated 대장균, 30 열 충격 시간 및 NZY + (또는 NZYM +) 미디어 성공적인 돌연변이 유발을 위해 중요하다. 가능하면, 새로운 제한 사이트를 만들고 추가 자동 변이를 엔지니어링하는 것은 아래의 돌연변이 식민지를 심사 편리하실 수 있습니다. 2. Miniprep, DNA 시퀀싱 및 Maxiprep 2.1 Qiagen miniprep 및 시퀀싱. 개인 세균성 식민지가 들어서 암피실린 (AMP)와 LB의 수프에서 재배하고 있습니다. 우리는 cDNA를 정화에 대한 제조 업체의 지침을 따릅니다. 제한 사이트가 위의 1 단계에서 통합하는 경우에는 간단한 제한 소화는, 돌연변이의 성공적인 도입 확인할 수 있습니다. 자동 DNA 시퀀싱이 꺼져 사이트 완료 및 cDNA의 변이의 존재를 확인하기 위해 필수적이다뿐만 아니라, 원치 않는 돌연변이가 있는지 여부를 평가합니다. 이 단계는 매우 중요합니다. 우리는 순서 앞으로 T7 프로 모터 및 BGH 시퀀싱 primers 리버스를 사용하여 전체 GIRK 코딩 순서를 그 pcDNA3.1 플라스미드의 측면 여러 복제 사이트. 참고 : 조심스럽게 시퀀싱 데이터의 충분한 품질을 보장​​하기 위해 시퀀싱 electropherogram를 검사하는 것이 중요합니다. 고품질 electropherogram는 작은 잡음과 날카로운 아닌 중복 봉우리가 있습니다. 2.2 Qiagen maxiprep. 우리는 제조 업체의 지침을 따릅니다. 참고 :이 단계는 우리가 효율적인 transfection을 위해 중요하다 발견 cDNA의 순도를 개선하기위한 실험에 포함되어 있습니다. 3. HEK293T 셀의 문화와 Transfection 이러한 모든 방법은 무균 조직 문화 후드에서 수행되어야합니다. 3.1 세포 배양 HEK293T 세포들은 (37 ° C. 5 % CO 2 humidified 인큐베이터) 문화에 쉽게되기 때문에 사용이 편리합니다 빠른 복제 시간, 높은 transfection 효율을 가지고 있으며 전체 세포 패치 – 클램프 전기 생리학 의무가 있습니다. HEK293T 전지는 플라스미드 pcDNA3.1의 episomal 복제를 보장 SV40 큰 T 항원을 표현. HEK293T 세포는 L – 글루타민과 함께 보충 낮은 포도당 DMEM 미디어와 10 % 태아 소 혈청 (FBS)의 양식입니다. passaging 세포, 세포가 / FBS를 포함하는 새로운 미디어를 추가하여 효소 활동을 중지 후, 조직 접시에서 분리 때까지 기다려, 트립신 / EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 합류 (90-95%) HEK293T 세포에 0.25 %를 추가합니다. 플레이트 ~ 1 X 10 5 셀 / 물론 함께 잘 당 항생제없는 문화 미디어 1 ML과 12 잘 세포 배양 접시에. (1 X 10 5 세포 10 ML 미디어 resuspended 합류 T25 플라스크에서 얻은 세포 현탁액의 ~ 350 μL입니다.) 3.2 Transfection 8-24 시간 후, HEK 세포가 플라스틱을 준수하고 transfection 준비합니다. cDNA 0.2 μg 채널, Invitrogen Lipofectamine 2000을 사용하는 cDNA 0.4 μg의 M2R 수용체 cDNA와 0.04 μg의 YFP와 Transfect 세포. 참고 :이 성공적으로 (녹색 세포가 가능성이 GIRK 채널과 M2 수용체 모두를 포함) transfected있는 세포를 확인하기 위해 cDNA YFP의 소량을 사용합니다. 사용하는 cDNA의 농도는 각 클론에 따라 조정해야합니다. transfected 세포의 형광 시각화 3.3. 장소는 12 – 잘 바뀌 형광 현미경의 무대에 접시와 YFP 표현 세포를 검사합니다. DIC 이미지를 비교하고 녹색 세포의 대략적인 개수를 적어 둡니다. 이것은 transfection 효율을 예측할 수 있습니다. 24 잘 요리와 폴리 – D – 라이신 코팅 커버 풀렸는데 3.4 준비 탈이온수로 세탁과 야간 95 % 에탄올에 흔들어 다음, Radiacwash과 함께 하루를 흔들어하여 12mm 유리 커버 풀렸는데 (워너, CS – 12R)를 청소합니다. 사용까지 70 % 에탄올에 깨끗한 커버 전표를 저장합니다. 에탄올과 페트리 접시, 포셉 및 버너를 사용하여 에탄올에서 불꽃,에 넣어 커버 풀렸는데멸균 24 잘 판 잘 하나에서 D 플레이스. 폴리 – D – 라이신 250 μL (PDL) 솔루션 각각 잘 커버 [0.2 MG / ML]와 커버 전표가 하룻밤 사이에 불임 후드 아래에 PDL 솔루션에 열중 앉아 보자. 증발을 피하기 위해 Parafilm에 24 접시를 잘 싸서. 다음 날 아침, PDL을 기음과 멸균 물로 2 배 씻는다. 플레이트 커버 후, 후드 아래에 건조 열어두고. 코팅 커버 전표로 24 잘 요리는 무균 알루미늄 호일로 싸서 주 동안 실온에서 저장할 수 있습니다. 커버에 3.5 도금 transfected HEK293T 전지는 풀렸는데 24 유리 커버를 포함 24 자 요리 (~ 4 X 10 3 셀 / 음)에 transfection, 세포 분할 후 폴리 – D – 라이신과 코팅 전표. 참고 : transfected 세포는 24-72 시간 게시물 transfection까지 사용할 수 있습니다. 세포 패치 클램프 전기 생리학 실험 개별 표지 전표를 제공하기 위해 분할됩니다. 4. 전기 생리학 4.1 준비 솔루션 세포외 (목욕) 솔루션 : 20 MM KCl, 140 MM NaCl, 0.5 MM CaCl 2, 2 MM MgCl 2, 10 MM HEPES (NaOH로 pH를 7.4로 설정). 나누어지는 20K 목욕 솔루션과 적절한 모듈 레이터를 추가 20K + 바 2 + : 1 MM BaCl 2가 포함된 솔루션 : 내향 정류 전류 특정 억제제 20K + Carbachol : 5 μm의 Carbachol와 솔루션 : 특정 M2R의 작용제, G – 단백질 M2R 커플 오픈 GIRK 채널 20K + 에탄올 직접 GIRK 채널을 활성화 100 MM의 EtOH를 포함하는 욕실 솔루션 플레이스 목욕 솔루션의 신속한 교환 재관류 시스템의 주사기 (솔루션 용기)에. 참고 : 우리는 목욕 솔루션을 제어하는​​ 워너 핀치 밸브 시스템을 사용합니다. PE 관을 권장합니다. 내부 / 전극 솔루션 : 140 MM KCl, 20 MM NaCl, 5 MM EGTA, 5.4 MM MgCl 2, 2.5 MM K 2 ATP 및 0.3 μm의 리튬이 GTP 10 MM HEPES (pH는 7.4). 우리는 ATP와 GTP없이 전극 솔루션을합니다. 우리는 개별적으로 -80 ° C에 저장되어있는 ATP와 GTP의 aliquots, 준비 및 실험 당일에 전극 솔루션에 추가할 수 있습니다. 우리는 ATP / GTP을 유지하기 위해 얼음 최종 전극 솔루션 주사기를 유지. 우리는 살균 필터 (0.2 μm의) 내부 / 외부 솔루션은 미생물 성장을 억제하고 튜브를 경화를 일으키는 가능성과 전극을 줄일 수 있습니다. 4.2 풀링 전극 우리는 세포 솔루션으로 가득 저항 MΩ 3-7로 전극을 얻기 위해 Narishige 두 단계 수직 풀러와 워너 악기 (1.5 mm 외경, 0.86 mm 내경과 7.5 cm의 길이)에서 borosilicate 유리 전극을 사용합니다. 참고 :이 실험적으로 귀하의 연구실에있는 전극 풀러와 전극 유리의 종류에 대한 매개 변수를 결정하기 위해 필요합니다. 우리 수직 풀러 위해, 우리는 두 번째 당기의 첫 번째 뽑아 ~ 43에 대해 60.2의 열 설정을 사용합니다. 클램핑 4.3 전체 세포 패치 거꾸로 형광 현미경의 무대에서 외부 솔루션과 장소 요리와 커버, 바셀린의 소량을 사용하여 35mm 접시에 용지를 커버 마운트합니다. 세포를 집중하고 찾을 수 DIC 사용 YFP 긍정적인 세포를 찾을 수 형광 YFP로 전환합니다. 녹색 셀 (간격 관심 = 2-3 셀 길이의 셀 20-30 μm의) 근처 재관류 매니폴드의 위치 팁. 게인 1, 구성 : 전체 세포 β = 1, 모드 V – 클램프 솔루션 전극을 채우기 다음과 같은 초기 설정으로 Axopatch 200B 앰프의 headstage (액슨 악기)에 첨부합니다. 피펫의 막히는 것을 방지하고, 그냥 셀 위에 전극 팁 곳으로 조작하는 사람을 사용하여 전극에 대한 긍정적인 압력을 적용합니다. 피펫의 가능성을 제로, 테스트 전압 단계를 제공하기 위해 인감 테스트 버튼을 선택합니다. 5 MV 직사각형 전압 단계 Clampex의 인감 테스트 창에 나타납니다. 0 NA 현재의 기본 라인을 가지고 앰프에 피펫 오프셋 전위차를 조정합니다. 또는, V 트랙 모드와 "0.00"로 앰프 미터 디스플레이에 전압을 제공할 수 앰프에 피펫 오프셋 전위차를 Vtrack 사용하는 미터 노브로 선택기 앰프 모드를 전환하여 피펫의 가능성을 제로. Clampex 8.2 소프트웨어 (MΩ 3-7한다)의 인감 테스트 명령을 사용하여 전극의 저항을 확인하십시오. 저장된 프로토콜 파일을 열거나 새로운 프로토콜을 만들 수 있습니다. 프로토콜 파일을 열려면 주 메뉴에서 선택한 다음 열기 프로토콜을 습득하고 저장된 전압 프로토콜 파일을 선택합니다. 본 실험의 경우, 프로토콜 2 이상 40 뮤직 비디오로 -100 뮤직 비디오와 진입로로 한 50 MS 전압 단계를 제공합니다, – 40mV에서 막 잠재력을 보유하기 위해 만들어졌습니다00 MS. 이 프로토콜은 매 2 초 실행됩니다. 램프 프로토콜 GIRK 채널의 반전 잠재력과 내향 정류 관찰을 허용합니다. 전압 – 게이 티드 이온 채널에 대한, 직사각형 전압 단계는 더 적절할 수 있습니다. 조작하는 사람의 미세한 조절을 사용하여 접근 세포는 긍정적인 압력을 풀어 세포 표면을 만져 후 부정적인 압력을 적용하고, 인감 테스트 오실로 스코프 윈도우에서 저항의 증가를 모니터링합니다. 일단 저항이 GΩ 범위에, 전극은 멤브레인 (Gigaseal가 형성 하였다)에 봉인했습니다. 세포막을 아프게하고 셀에 대한 액세스를 얻을 부정적인 압력의 펄스를 적용합니다. 일단 전체 셀 구성에서, 당신은 등록 용량성 전류를 증가합니다. Clampex에서 막 테스트로 전환하여 접근 저항 라, 멤브레인 저항 RM, 막 커패시턴스 CM을 작성하고 눈 실제 capacitative 현재에 대한 이론 곡선의 기하 급수적인 맞지로 확인합니다. 멤브레인 커패시턴스는 셀 크기에 비례하고 전류 밀도를 계산하기 위해 나중에 사용됩니다. 10 kHz에서시 -40 뮤직 비디오와 필터 V – 아웃 (막 잠재력)을 설정 테스트를 봉쇄로 다시 전환 다음 단계로 앰프에 막 커패시턴스와 직렬 저항 보상 : 에 전체가 CELL 캡 스위치를 전환합니다. 당신은 평면 테스트 펄스를 얻을 때까지 앞뒤로 완전 세포 CAP와 직렬 저항의 다이얼을 조정하십시오. 당신은 또한 피펫의 용량 FAST CAP 손잡이를 조정해야 할 수도 있습니다. 60-80 % 정도로 %의 예측 손잡이를 켜고, 다시 재 조정 완전 세포 CAP 및 직렬 저항 다이얼을 (당신이 피펫 커패시턴스 보상 FAST 뚜껑 손잡이로 잘 조정해야 할 수도 있습니다.) 다시 조정 완전 세포 CAP 및 직렬 저항 (이 피펫 커패시턴스 보상 FAST CAP 손잡이로 잘 조정해야 할 수도 있습니다)에 의해 펄스가 평평하게 유지하는 동안, 세포를 진동하지 않고 % 광고 – 100 %를 켭니다. 시간이 지속 감소하여 지연을 조정합니다. CM (멤브레인 용량), RS (직렬 저항), %의 광고에 대한 값을 적어 %는 PRED 및 지연 시간은 노트북의 앰프에 설정합니다. CM 및 RS 위의 멤브레인 테스트에서 측정 CM과 RM과 같은 거의 동일해야합니다. 목욕 솔루션을 제어하는​​ 외부 솔루션 밸브를 켭니다. 2kHz로 앰프 8 폴 베셀 필터를 설정 전압 클램프 프로토콜을 열고 녹음 전류를 시작합니다. 우리는 100 MV 200 MS 이상 40 MV 50 MS 다음 경사로를위한 -100 MV 단계와 매 2 초 전달 램프 프로토콜을 사용 GIRK 전류를 기록합니다. 램프 프로토콜은 반전 가능성의 관찰과 GIRK 채널의 안쪽 정류 속성에 대한 수 있습니다. 상온에서 (22-25 ° C), 현재 GIRK 근처 K (E K = -50 MV)에 대한 계산 평형 잠재력 가까이 -50 MV을 (목욕탕에서 20 밀리미터의 KCl과), 반대한다, 그때 남아 E K 긍정적인 잠재력에 상당히 평면. 실험 프로토콜 : 안정 기준을 녹화 후, + Carbachol 솔루션 20K로 전환하고 20K 목욕 솔루션으로 전환, 응답의 최대 기다리는 다음, 20K 이상의 에탄올을 적용하고 최대 응답을 기다 후 20K 목욕 솔루션으로 전환하고, 마지막으로 20K + 바 2 + 솔루션입니다. 이러한 약물의 응용 프로그램을하는 동안 당신은 GIRK 조류 (대부분 -100 뮤직 비디오에서 발음)의 진폭의 변화를 볼 수 있습니다. 노트북 다른 세포 솔루션의 응용 프로그램에 해당하는 추적 번호를 적어 둡니다. 단일 Clampfit 파일은 전체 실험에​​ 대한 감시 장치를 모두 포함됩니다. 5. 데이터 분석 우리는 -100 뮤직 비디오에서 데이터를 GIRK 전류를 분석 Clampfit 9.2 소프트웨어를 사용합니다. , 녹음과 파일을 열고 -100 MV에서 커서를 설정합니다. 기본적으로 당신은 화면에 중첩의 모든 흔적을 볼 수 있습니다. "커서 쓰기"아이콘을 누르면 당신은 수치 데이터를 엑셀과 같은 스프레드 시트를 생성합니다. 할당 X으로 추적 번호 열 및 커서 컬럼에 Y로하고 빠르게 실험 시간 코스 계획을 그릴 수있는 "그래프 만들기"아이콘을 누르면. + 혼자 외부 재관류 솔루션 ( "20K 현재"마이너스 "20K + 바 2 + 전류")에 기록된 현재의 바 2 면전에서 현재 빼서의 기저 전류를 계산합니다. 활성 전류에서 20K의 기저 전류를 빼서하여 유도 전류를 계산 ( "20K + Carbachol 현재"마이너스 "20K 현재"; "20K + 에탄올 현재"마이너스 "20K 현재"). 멤브레인 커패시턴스 (앰프에서 직접 읽어)에 의해 전류를 나누어 전류 밀도 (PA / PF)을 계산합니다. 기초 전류에 의해 유도 전류를 나누어 100으로 곱하여 %의 정품 인증을 계산합니다. 6. 대표 결과 당신은 야생 타입 채널 transfected 세포에서 현재 레코드 수 있어야합니다. GIRK 채널 측정을위한20 MM을 포함하는 세포외 용액에 D K + (K + 세포와 145 ㎜)들은 강한 내면 정류 및 칼륨 채널의 필수 속성입니다 ~ -50 뮤직 비디오의 반전 가능성을 전시한다. 야생 형 전류 carbachol 응용 프로그램 (기초 전류 이상 3-5 배 증가)에 따라 강력하게 증가하고 100 MM 에탄올에 유사하게 반응합니다. 참고 : 전기 생리학을위한 서명 대회 그 안으로 현재는 부정되고 외부 전류가 긍정적입니다. GIRK2의 알코올 바인딩 주머니에 L257W 돌연변이 들어, carbachol과 에탄올 모두 감쇠 응답을 볼 수 있습니다. 이것은 L257이 알콜과 GIRK2 채널의 G 단백질 활성화에 관여 제안합니다. GIRK2 돌연변이 유발의 결과에 대한 예제를 보려면 Aryal 외에 의해 최근에 게시를 참조하십시오. 1. 그림 1. 야생 형 GIRK2 기록에 대한 Clampfit 8.0 보여주는 데이터 파일의 창. 왼쪽 상단에 패널이 겹쳐 다른 바하 외부 솔루션의 존재에 램프 전압 프로토콜에 대한 응답으로 기록 지나간다 보여줍니다. 커서 1 -100 뮤직 비디오에 배치됩니다. 커서 값은 스프레드 시트 (오른쪽 패널)에 기록됩니다. 왼쪽 하단 패널은 스위프 수와, 현재의 줄거리를 보여줍니다. 에탄올 (EtOH)와 carbachol (수화물)과 바 2 +와 현재의 억제와 전류의 증가 (아래 편향)을합니다. 그림 2. 돌연변 GIRK2 – L257W 녹음 Clampfit 8.0 보여주는 데이터 파일의 창. 설명은 그림 1에서와 같이 동일합니다. carbachol (수화물) 활성화 및 돌연변이 채널에 EtOH – 유도 전류의 감소의 손실을합니다.