1. Site Dirigido Mutagênese Usamos a expressão de mamíferos pcDNA3.1 plasmídeo um cDNA para GIRK2 e introduzir uma mutação pontual usando Stratagene (Agilent Technologies) Quikchange XL II sítio-dirigida mutagênese kit, de acordo com as instruções do fabricante. Seqüência de primers podem ser facilmente gerados usando o programa de design online cartilha disponível em: https://www.genomics.agilent.com/CollectionSubpage.aspx?PageType=Tool&SubPageType=ToolQCPD&PageID=15 Nota: Usamos padrão Eppendorf tubos de 1,5 mL no lugar de BD 14 tubos mL descrita no protocolo. No entanto, o uso de XL10-Gold E. ultracompetent coli pré-tratados com β-mercaptoetanol, 30s tempo de choque térmico e NZY + (ou NZYM +) media são críticos para o sucesso mutagênese. Se possível, engenharia de uma mutação adicional silenciosa que cria um site nova restrição pode ser conveniente para a triagem colônias mutantes abaixo. 2. Miniprep, seqüenciamento de DNA e Maxiprep 2,1 Qiagen miniprep e seqüenciamento. Individuais colônias bacterianas são colhidos e cultivados em caldo LB com ampicilina (AMP). Seguimos as instruções do fabricante para purificar o cDNA. Um digest restrição simples pode ser usada confirmar a introdução bem sucedida da mutação, se um sítio de restrição é incorporada no passo 1 acima. Automatizados de seqüenciamento de DNA é feito fora do local, e é essencial para confirmar a presença da mutação no DNA, bem como avaliar se há qualquer mutação indesejada. Este passo é muito importante. Nós seqüência a seqüência GIRK toda codificação usando frente e verso T7 promoter BGH primers de seqüenciamento que o flanco sítio múltiplo de clonagem do plasmídeo pcDNA3.1. Nota: É importante inspeccionar cuidadosamente o electroferograma seqüenciamento suficiente para garantir a qualidade dos dados de seqüenciamento. Electroferograma de alta qualidade tem nítidas, sem sobreposição picos com ruído de fundo pouco. 2,2 maxiprep Qiagen. Seguimos as instruções do fabricante. Nota: Esta etapa é incluída em nossos experimentos para melhorar a pureza do cDNA, o que encontramos é importante para a transfecção eficiente. 3. Cultura e transfecção de células HEK293T Todas estas etapas devem ser feitas em uma capa estéreis de cultura de tecidos. 3,1 de cultura de células HEK293T células são fáceis de usar, porque eles são fáceis de cultura (37 ° C, 5% CO 2 incubadora umidificada), tem tempo de replicação rápida, a eficiência de transfecção alta e são passíveis de células inteiras eletrofisiologia patch-clamp. Células HEK293T expressar SV40 antígeno T grande que garante a replicação epissomal de pcDNA3.1 plasmídeo. HEK293T células são cultivadas em baixa de glicose DMEM meio suplementado com L-glutamina e 10% soro fetal bovino (FBS). Para as células passaging, adicionar 0,25% de tripsina / EDTA para as células confluentes (90-95%) HEK293T, espere até que as células destacar do prato tecido, então pare a atividade da enzima através da adição de novas mídias contendo FBS /. Placa ~ 1 X 10 5 células / poço em uma placa de cultura de células de 12 poços, juntamente com 1 mL de mídia livre de antibióticos cultura por poço. (1 X 10 5 células é de aproximadamente 350 mL de suspensão de células obtidas a partir frasco T25 confluentes ressuspendido com 10 mL de mídia). 3,2 Transfection Após 24/08 horas, as células HEK irá aderir ao plástico e estão prontos para transfecção. Transfecção de células com 0,2 mg canal cDNA, 0,4 g M2R YFP mg receptor cDNA e 0,04 cDNA usando Invitrogen Lipofectamine 2000. Nota: usamos uma pequena quantidade de cDNA YFP para determinar quais células são sucesso transfectadas (células verdes provavelmente irá conter ambos os canais GIRK e receptores M2). A concentração de cDNA de usar terá de ser ajustada para cada clone. 3,3 visualização de fluorescência de células transfectadas. Coloque placa de 12 bem no palco de um microscópio invertido de fluorescência, e examinar as células de expressão YFP. Compare a imagem DIC e anote o número aproximado de células verde. Esta fornece uma estimativa da eficiência de transfecção. 3,4 Preparação de 24 poços pratos e Poly-D-lisina lamínulas revestido Limpa 12 milímetros desliza tampa de vidro (Warner, CS-12R), agitando-los durante a noite com Radiacwash, seguido por lavagem com água deionizada e agitação durante a noite em etanol 95%. Armazenar as lamínulas limpa em etanol 70% até o uso. Lugar lamínulas em placas de Petri com etanol, chama off etanol utilizando fórceps e gravador, umd lugar em um poço de uma placa 24 estéril também. Cobrir todos os poços com 250 mL de poli-D-lisina (PDL) solução [0,2 mg / mL] e deixe o lamínulas se sentar durante a noite imersos em solução PDL sob o capô estéril. Enrole a placa de 24 poços em Parafilm para evitar a evaporação. Na manhã seguinte, aspire PDL e lavar 2x com água estéril. Deixe placas aberta para secar sob o capô, em seguida, cobrir. Os 24 pratos bem com lamínulas revestido pode ser embrulhado com papel de alumínio esterilizado e armazenado em temperatura ambiente por semanas. 3,5 Plating células transfectadas HEK293T na capa desliza 24h após a separação de transfecção, as células em 24 bem-prato (~ 4 X 10 3 células / poço) contendo tampa de vidro desliza revestidas com poli-D-lisina. Nota: as células transfectadas pode ser usado até 24-72 transfecção pós hrs. As células são divididas para fornecer lamínulas individuais para correção experimento de eletrofisiologia grampo. 4. Eletrofisiologia Preparando 4,1 Solutions Solução (banho) extracelular: 20 mM KCl, 140 mM NaCl, 0,5 mM CaCl 2, 2 mM MgCl 2 e 10 mM HEPES (pH 7,4 set com NaOH). Alíquota de solução de banho de 20K e adicionar moduladores apropriado 20K + Ba 2 +: solução contendo 1 mM BaCl 2: um inibidor específico da retificação dentro correntes 20K + carbacol: solução com 5 mM carbacol: um agonista M2R específicos; casais M2R a G-proteínas que canais abertos GIRK 20K + Etanol: solução de banho, contendo 100 mM EtOH para ativar canais GIRK diretamente Coloque soluções banho em seringas (contentores solução) do sistema de troca rápida de perfusão. Nota: Nós usamos um sistema de válvula Warner pitada de controlar as soluções de banho. Tubulação de PE é recomendado. Eletrodo solução interna /: 140 mM KCl, 20 mM NaCl, 5 mM EGTA, 5,4 mM MgCl 2, 10 mM HEPES (pH 7,4) com 2,5 mM K 2 ATP e 0,3 mM Li 2 GTP. Nós fazemos a solução do eletrodo sem ATP e GTP. Nós separadamente preparar alíquotas de ATP e GTP, que são armazenadas a -80 ° C, e adicionar à solução de eletrodos no dia do experimento. Mantemos seringa com a solução final sobre eletrodo de gelo para preservar o ATP / GTP. Nós filtro estéril (0,2 mm) as soluções interno / externo para inibir o crescimento microbiano e reduzir a possibilidade de entupimento dos tubos eo eletrodo. 4,2 eletrodos Pulling Usamos Narishige extrator de duas etapas vertical e eletrodo de vidro de borosilicato da Warner Instrumento (1,5 mm de diâmetro externo, 0,86 mm de diâmetro interno e 7,5 cm de comprimento) para obter eletrodos com 3-7 mohms de resistência quando preenchido com solução intracelular. Nota: É necessário determinar experimentalmente os parâmetros para o puxador de eletrodo e do tipo de vidro do eletrodo em seu laboratório. Para o nosso puxador vertical, usamos uma configuração de calor de 60,2 para a primeira puxada e ~ 43 para a atração segundo. 4,3 Whole-cell patch de fixação Montagem tampa de deslizamento em um prato de 35 milímetros usando pequena quantidade de vaselina, cubra com solução externa e antena lugar no palco de um microscópio invertido de fluorescência. Use DIC para se concentrar e encontrar células, mudar para YFP fluorescência para localizar YFP células positivas. Ponta posição do colector de perfusão perto de uma célula verde (20-30 M a partir da célula de interesse comprimento celular = 2-3 intervalo). Preencha eletrodos com solução, anexá-lo ao headstage de Axopatch amplificador 200B (Axon Instruments) com as seguintes configurações iniciais: Ganhe 1, Configuração: conjunto de células β = 1, o modo V-clamp. Aplique uma pressão positiva sobre eletrodo para evitar o entupimento da pipeta, e usar o manipulador de colocar ponta do eletrodo apenas acima da célula. Para o potencial Zero pipeta, selecione o botão de teste Seal para entregar um passo tensão de teste. A tensão de 5 mV passo retangular aparecerá na janela de teste Selo de Clampex. Ajuste o potenciômetro Pipetar offset do amplificador para trazer a linha de base atual a 0 nA. Alternativamente, zero o potencial pipeta mudando o modo de amplificador seletor para V-track modo eo botão medidor para Vtrack e utilizar o potenciômetro Pipetar offset do amplificador para elevar a tensão no visor metros amplificador para "0.00". Verifique a resistência do eletrodo usando o comando selo teste do 8,2 Clampex software (deve ser mohms 07/03). Abrir um arquivo salvo protocolo ou criar um novo protocolo. Para abrir o arquivo protocolo selecionar no menu principal Adquirir Protocolo, em seguida, Abrir e escolha um arquivo salvo protocolo de tensão. Para este experimento, o protocolo foi criado para conter o potencial de membrana de-40mV, entregar um único passo de tensão 50 ms a -100 mV e 40 mV rampa de acesso para mais de 200 ms. Este protocolo é executado a cada 2 segundos. O protocolo de rampa permite a observação da rectificação reversão em potencial e para dentro de canais GIRK. Para os canais iónicos dependentes de voltagem, um degrau de tensão retangular pode ser mais apropriado. Célula abordagem utilizando o ajuste fino do manipulador, a liberação de pressão positiva, depois de tocar a superfície da célula aplicar pressão negativa, e monitorar aumento da resistência na janela osciloscópio Seal Test. Uma vez que a resistência está na faixa GÊ, o eletrodo foi selado membrana (Gigaseal formou). Aplicar um pulso de pressão negativa para quebrar a membrana celular e tenha acesso na célula. Uma vez em toda a configuração de célula, você irá registrar aumento correntes capacitivas. Mude para o Teste de Membrana em Clampex e anote o acesso a resistência Ra, Rm resistência da membrana, Cm capacitância de membrana e verificar pelo olho do ajuste exponencial da curva teórica para a corrente capacitiva reais. Capacitância da membrana é proporcional ao tamanho da célula e serão utilizadas posteriormente para calcular a densidade de corrente. Voltar para o Selo de teste, conjunto V-Out (potencial de membrana) a -40 mV e filtro de 10 kHz Compensar a capacitância de membrana e resistência em série no amplificador com as seguintes etapas: Mudar o interruptor CAP TODO celular. Ajuste CAP células inteiras e mostradores resistência em série e para trás, até obter um pulso de teste plana. Você também pode precisar de ajustar capacitância pipeta botão CAP FAST. Ligue o botão PREVISÃO% para cerca de 60-80%, novamente re-ajustando CAP células inteiras ea marcação resistência em série (você pode ter que ajustar a compensação de capacitância pipeta botão CAP rápido também). Ligue% COMP-a 100%, sem oscilação da célula, enquanto tenta manter o pulso flat reajustando CAP células inteiras e resistência em série (você pode ter que ajustar a compensação de capacitância pipeta botão CAP rápido também). Ajustar o lag, reduzindo o tempo constante. Anote os valores de Cm (capacitância de membrana), Rs (resistência em série), COMP%, PRED% e tempo de atraso definido no amplificador no notebook. O Cm e Rs deve ser aproximadamente o mesmo que o Cm e Rm medido no teste de membrana acima. Ligue válvula solução externa para controlar a solução do banho. Definir o amplificador de 8 pólos do filtro de Bessel de 2kHz, abra um protocolo de fixação de tensão e correntes começar a gravação. Gravamos correntes GIRK usando um protocolo de rampa que os passos a -100 mV para 50 ms, em seguida, rampas de 100 mV a 40 mV mais de 200 ms e é entregue a cada 2 segundos. O protocolo de rampa permite a observação do potencial de reversão e de propriedade de retificação para dentro de canais GIRK. À temperatura ambiente (22-25 ° C), o GIRK atual deve reverter perto -50 mV (com 20 mM KCl no banho), que está perto do potencial de equilíbrio calculado para K (E K = -50 mV), então permanecem bastante plana em potenciais positivos para E-K. Protocolo experimental: Após a gravação de uma linha de base estável, mude para solução de 20K + carbacol e aguarde pico de resposta, voltar para 20K solução de banho, em seguida, aplicar 20K + Etanol e aguardar resposta de pico, em seguida, mudar para 20K solução do banho e, finalmente, 20K + Ba 2 + solução. Durante a aplicação destas drogas você verá mudanças na amplitude de GIRK correntes (mais pronunciada a -100 mV). Anote o número do traço correspondente à aplicação de diferentes soluções extracelular no notebook. Um arquivo Clampfit único conterá todas as varreduras em busca de todo o experimento. 5. Análise de Dados Usamos Clampfit software 9.2 para analisar os dados correntes GIRK a -100 mV. Abra o arquivo com a gravação, conjunto cursor a -100 mV. Por padrão, você verá todos os traços sobrepostos na tela. Ao pressionar "Write cursores" ícone que você irá criar Excel-como planilha com dados numéricos. Através da atribuição de X para a coluna número de rastreamento e Y para a coluna de cursor e pressionando "Criar Gráfico" ícone você pode rapidamente desenhar um gráfico tempo-curso do experimento. Calcular corrente basal subtraindo atual em presença de Ba 2 + a partir de corrente registou em solução de perfusão externo sozinho ("20K atual" minus "20K + Ba 2 + atual"). Calcular as correntes induzidas subtraindo atual basal em 20K das correntes ativadas ("20K + carbacol atual" minus "20K atual", "Etanol 20K + atual" minus "20K atual"). Calcular a densidade de corrente (pA / pF) dividindo-se a corrente pela capacitância de membrana (leia-se directamente a partir do amplificador). Calcular a ativação por cento dividindo correntes induzidas por correntes basal e multiplicando por 100. 6. Resultados representante Você deve ser capaz de registro atual a partir de células transfectadas com canais do tipo selvagem. Para GIRK medida canaisd na solução extracelular contendo 20 mM K + (e 145 mM K + intracelular) que deve apresentar retificação interna forte e um potencial de reversão de ~ -50 mV, que é uma propriedade essencial de canais de potássio. A corrente do tipo selvagem vai aumentar fortemente sobre carbacol aplicação (3-5 vezes ao longo aumentar atual basal) e responder de forma semelhante ao etanol 100 mM. Nota: a convenção de sinais para eletrofisiologia é que a corrente é negativa para dentro e para fora atual é positivo. Para a mutação L257W no bolso álcool ligação de GIRK2, você vai ver as respostas atenuadas a ambos carbacol e etanol. Isto sugere que a L 257 está envolvido em álcool e ativação da proteína G de GIRK2 canais. Para mais exemplos dos resultados da GIRK2 mutagênese, consulte a publicação recente de Aryal et al. 1. Figura 1. Janela de 8,0 Clampfit arquivo de dados para shows do tipo selvagem de gravação GIRK2. Painel superior esquerdo mostra sobreposta registros gravados em resposta a um protocolo de rampa de tensão na presença de diferentes soluções externas bah. Cursor é posicionado em um -100 mV. Os valores de cursor são escritos para a planilha (painel direito). Painel inferior esquerdo mostra o gráfico do número de varredura contra, atual. Observe o aumento da corrente (deflexão para baixo) com etanol (EtOH) e carbacol (Carb) e inibição atual com Ba 2 +. Figura 2. Descrições de janela de 8,0 Clampfit arquivo de dados para uma gravação mostra GIRK2-L257W mutante. São os mesmos que na Figura 1. Observe a perda de carbacol ativação (Carb) e redução de EtOH induzida por correntes nos canais de mutantes.
