1. Ortsspezifische Mutagenese Wir verwenden Säugetieren Expressionsplasmid pcDNA3.1 Kodierung einer cDNA für GIRK2 und die Einführung einer Punktmutation mit Stratagene (Agilent Technologies) Quikchange XL II Mutagenese-Kit nach den Anweisungen des Herstellers. Primer-Sequenz kann leicht erzeugt werden mittels Online-Primer-Design-Programm finden Sie unter: https://www.genomics.agilent.com/CollectionSubpage.aspx?PageType=Tool&SubPageType=ToolQCPD&PageID=15 Hinweis: Wir verwenden Standard-Eppendorf 1,5 ml Röhrchen anstelle von BD 14 ml-Röhrchen in das Protokoll beschrieben. Allerdings ist die Verwendung von XL10-Gold ultracompetent E. coli vorbehandelt mit β-Mercaptoethanol, 30s Hitzeschock Zeit und NZY + (oder NZYM +) Medien sind entscheidend für die erfolgreiche Mutagenese. Wenn möglich, kann eine zusätzliche Engineering stille Mutation, die eine neue Restriktionsschnittstelle schafft praktisch sein für das Screening Mutantenkolonien unten. 2. Miniprep, DNA-Sequenzierung und Maxiprep 2,1 Qiagen Miniprep und Sequenzierung. Individuelle Bakterienkolonien werden gepflückt und aufgewachsen in LB-Medium mit Ampicillin (AMP). Wir folgen den Anweisungen des Herstellers für die Reinigung der cDNA. Eine einfache Restriktionsverdau kann bestätigen die erfolgreiche Einführung der Mutation verwendet werden, wenn eine Restriktionsschnittstelle in Schritt 1 oben eingebaut wird. Automatisierte DNA-Sequenzierung ist off-site, getan und ist von wesentlicher Bedeutung, um das Vorhandensein der Mutation in der cDNA zu bestätigen, als auch zu beurteilen, ob es irgendwelche unerwünschte Mutationen. Dieser Schritt ist sehr wichtig. Wir sequenzieren das gesamte GIRK kodierende Sequenz mittels Forward-und Reverse-T7-Promotor BGH Sequenzierungsprimern dass Flanke multiple Klonierungsstelle des pcDNA3.1 Plasmid. Hinweis: Es ist wichtig, sorgfältig zu untersuchen die Sequenzierung Elektropherogramm, um eine ausreichende Qualität der Sequenzierung Daten zu gewährleisten. Hochwertige Elektropherogramm hat scharfe, nicht-überlappenden Peaks mit wenig Hintergrundgeräuschen. 2,2 Qiagen Maxiprep. Wir folgen den Anweisungen des Herstellers. Hinweis: Dieser Schritt ist in unseren Experimenten enthalten, um die Reinheit der cDNA, die wir finden, ist für eine effiziente Transfektion wichtig zu verbessern. 3. Kultur und Transfektion von Zellen HEK293T All diese Schritte sollten in einem sterilen Gewebekultur Haube getan werden. 3,1 Zellkultur HEK293T Zellen sind bequem zu bedienen, weil sie einfach zu Kultur (37 ° C, 5% CO 2 befeuchteten Inkubator), haben schnelle Replikation, hohe Transfektionseffizienz und sind zugänglich für whole-cell Patch-Clamp-Elektrophysiologie. HEK293T Zellen exprimieren SV40 large T Antigen, das episomalen Replikation von Plasmid pcDNA3.1 gewährleistet. HEK293T Zellen werden in DMEM mit niedrigem Glucosegehalt Medien mit L-Glutamin und 10% fötalem Rinderserum (FBS) gezüchtet. Für die Passage Zellen, fügen 0,25% Trypsin / EDTA zu konfluent (90-95%) HEK293T Zellen, warten, bis die Zellen aus dem Gewebe Gericht zu lösen, dann stoppen die Enzymaktivität durch Zugabe von frischem Medium mit FBS /. Platte ~ 1 X 10 5 Zellen / Well in eine 12-Well-Zellkulturschale zusammen mit 1 ml Antibiotika-freien Kulturmedien pro Vertiefung. (1 x 10 5 Zellen ~ 350 ul Zellsuspension aus konfluenten T25-Kolben mit 10 ml Medium resuspendiert erhalten). 3,2 Transfektion Nach 8-24 Uhr, wird HEK-Zellen am Kunststoff haften und sind bereit für die Transfektion. Transfektion von Zellen mit 0,2 ug Kanal cDNA, 0,4 pg M2R-Rezeptor-cDNA und 0,04 pg YFP cDNA mit Invitrogen Lipofectamine 2000. Hinweis: wir verwenden eine kleine Menge von YFP cDNA zu bestimmen, welche Zellen erfolgreich transfiziert (grüne Zellen wird wahrscheinlich enthalten sowohl GIRK Kanäle und M2-Rezeptoren). Die Konzentration der cDNA zu nutzen, müssen Sie für jeden Klon eingestellt werden. 3,3 Fluoreszenz Visualisierung von transfizierten Zellen. Legen Sie 12-Well-Platte auf der Bühne eines invertierten Fluoreszenzmikroskop und untersuchen Zellen für YFP Ausdruck. Vergleichen Sie DIC Bild und notieren Sie die ungefähre Anzahl der grünen Zellen. Dies ermöglicht eine Abschätzung der Transfektionseffizienz. 3.4 Vorbereitung der 24-Well-Schalen und Poly-D-Lysin beschichteten Deckgläsern Saubere 12 mm Glasdeckgläschen (Warner, CS-12R) durch Schütteln sie über Nacht mit Radiacwash, gefolgt von Waschen mit entionisiertem Wasser und über Nacht unter Schütteln in 95% Ethanol. Bewahren Sie die sauberen Deckgläschen in 70% igem Ethanol bis zur Verwendung. Legen Sie Deckgläser in einer Petrischale mit Ethanol Flamme aus Ethanol mit einer Pinzette und Brenner, eind in eine Vertiefung einer sterilen 24-Well-Platte. Abdeckung jedes Well mit 250 ul von Poly-D-Lysin (PDL)-Lösung [0,2 mg / mL] und lassen Sie die Deckgläser sich über Nacht in PDL-Lösung unter sterilen Haube getaucht. Wickeln Sie den 24-Well-Platte in Parafilm, um Verdunstung zu vermeiden. Am nächsten Morgen, absaugen und waschen PDL 2x mit sterilem Wasser. Lassen Platten offen unter der Haube trocknen, dann decken. Die 24 Well-Schalen mit beschichteten Deckgläser können in mit steriler Aluminiumfolie gewickelt und bei Raumtemperatur gelagert Wochen. 3,5 Plating transfizierten HEK293T Zellen auf dem Deckglas 24 Stunden nach der Transfektion, Teilen von Zellen in 24-Well-Platte (~ 4 X 10 3 Zellen / well) mit Glasdeckgläschen mit Poly-D-Lysin beschichtet. Hinweis: transfizierten Zellen können bis zu 24-72 Stunden nach der Transfektion verwendet werden. Die Zellen werden aufgeteilt auf einzelne Deckgläser für Patch-Clamp-Elektrophysiologie Experiment liefern. 4. Elektrophysiologie 4.1 Vorbereiten Lösungen Extrazelluläre (Bad) Lösung: 20 mM KCl, 140 mM NaCl, 0,5 mM CaCl 2, 2 mM MgCl 2 und 10 mM HEPES (pH 7,4 eingestellt mit NaOH). Aliquot 20K Badlösung und fügen entsprechende Modulatoren 20K + Ba 2 +: Lösung mit 1 mM BaCl 2: ein spezifischer Inhibitor der inneren Gleichrichtung Ströme 20K + Carbachol: Lösung mit 5 uM Carbachol: eine spezifische M2R Agonist; M2R Paare an G-Proteine, die offen GIRK Kanäle 20K + Ethanol: Badlösung mit 100 mM EtOH zu GIRK Kanäle direkt aktivieren Ort Bad Lösungen in Spritzen (Lösung Container) von den schnellen Austausch Perfusion System. Hinweis: Wir verwenden ein Warner Quetschventil System, das Bad-Lösungen zu kontrollieren. PE-Schlauch wird empfohlen. Intern / Elektrode-Lösung: 140 mM KCl, 20 mM NaCl, 5 mM EGTA, 5,4 mM MgCl 2, 10 mM HEPES (pH 7,4) mit 2,5 mM K 2 ATP und 0,3 uM Li 2 GTP. Wir machen die Elektrode Lösung ohne ATP-und GTP. Wir gesondert vorbereiten Aliquots von ATP und GTP, die bei -80 ° C gelagert werden, und fügen Sie die Elektrode Lösung auf dem Tag des Experiments. Wir halten Spritze mit endgültigen Elektrode Lösung auf Eis, um die ATP / GTP zu bewahren. Wir Sterilfilter (0,2 um) die interne / externe Lösungen für das mikrobielle Wachstum zu hemmen und zu reduzieren Möglichkeit einer Verstopfung der Rohre und der Elektrode. 4,2 Pulling Elektroden Wir verwenden Narishige zweistufigen vertikale Abzieher und Borosilikatglas Elektrode von Warner Instrument (1,5 mm Außendurchmesser, 0,86 mm Innendurchmesser und 7,5 cm Länge), um Elektroden mit 3-7 MOhm Widerstand, wenn sie mit intrazellulären Lösung gefüllt zu erhalten. Hinweis: Es ist notwendig, um experimentell zu bestimmen Parameter für die Elektrode Abzieher und die Art der Elektrode aus Glas in Ihrem Labor. Für unsere vertikale Abzieher, verwenden wir eine Kochstufe von 60,2 für das erste Zug-und ~ 43 für den zweiten Zug. 4,3 Whole-cell Patch-Clamp- Berg Deckglas in einer 35-mm-Schale mit wenig Vaseline, Deckel mit externen Lösung und Ort Schüssel auf der Bühne eines invertierten Fluoreszenzmikroskop. Verwenden Sie DIC zu fokussieren und zu finden Zellen, Schalter auf YFP-Fluoreszenz zu YFP-positiven Zellen zu lokalisieren. Position Spitze der Perfusion vielfältig in der Nähe einer grünen Zelle (20-30 um aus der Zelle von Interesse = 2-3 Zelllänge abgesehen). Fill-Elektroden mit einer Lösung, hängen Sie es an die headstage von Axopatch 200B Verstärker (Axon Instruments) mit den folgenden Voreinstellungen: Gain 1, Konfiguration: whole-cell β = 1, mode V-Klemme. Bewerben Überdruck auf der Elektrode zu verhindern das Verstopfen der Pipette, und verwenden Sie den Manipulator Elektrodenspitze knapp oberhalb der Zelle zu platzieren. To Zero der Pipette Potenzial, wählen Sie das Seal Test, um eine Prüfspannung Schritt zu liefern. Die 5 mV rechteckförmige Spannung Schritt wird in der Seal-Test Fenster CLAMPEX erscheinen. Passen Sie die Pipette Offset-Potentiometer auf den Verstärker an die Basis-Linie auf 0 nA zu bringen. Alternativ Null der Pipette Potenzial durch Einschalten des Verstärkers Modus-Wahlschalter auf V-Track-Modus und das Messgerät Regler VTrack und verwenden Sie die Pipette Offset-Potentiometer am Verstärker, um die Spannung am Verstärker Meter Anzeige auf "0.00" zu bringen. Überprüfen Widerstand der Elektrode mit Dichtheitsprüfung Kommando der CLAMPEX 8.2 Software (sollte 3-7 MOhm sein). Öffnen einer gespeicherten Protokoll-Datei oder erstellen Sie ein neues Protokoll. So öffnen Sie Protokoll-Datei aus dem Hauptmenü wählen Sie übernimmt dann Open Protocol und wählen Sie eine gespeicherte Spannung Protokoll-Datei. Für dieses Experiment wurde das Protokoll erstellt, um Membranpotential at-40mV zu halten, liefern eine Einzeldosis von 50 ms Spannung Schritt bis -100 mV und Rampe bis +40 mV über 200 ms. Dieses Protokoll wird alle 2 Sekunden ausgeführt. Die Rampe Protokoll erlaubt die Beobachtung der Umkehr Potenzial und nach innen Nachbesserung GIRK Kanäle. Für Spannung Ionenkanälen kann eine rechteckige Spannung Schritt besser geeignet. Anfahrt Zelle mit Feineinstellung des Manipulators, lassen positive Druck, nach dem Berühren der Zelloberfläche gelten Unterdruck und überwachen Erhöhung des Widerstandes in der Seal-Test Oszilloskop-Fenster. Nach Widerstand in der GOhm Bereich ist, hat der Elektrode auf Membran (Gigaseal gebildet hat) abgedichtet. Tragen Sie einen Puls von Unterdruck an die Zellmembran zu durchbrechen und erhalten Zugang in die Zelle. Einmal in der whole-cell-Konfiguration, werden Sie kapazitiven Ströme erhöht registrieren. Switch to Membrane Test in CLAMPEX und notieren Sie sich den Zugang Widerstand Ra, Membranwiderstand Rm, Membran-Kapazität Cm und überprüfen Sie mit dem Auge die exponentielle Anpassung der theoretischen Kurve der realen kapazitiven Strom. Membrane Kapazität ist proportional zur Größe der Zellen und wird später verwendet werden, um die Stromdichte zu berechnen. Wechseln Sie wieder zu testen, legen Sie V-Out (Membranpotential) bis -40 mV und Filter bei 10 kHz Seal Ausgleich für Membran-Kapazität und Serienwiderstand am Verstärker mit den folgenden Schritten: Schalten Sie die gesamte Zelle CAP einschalten. Passen Whole Cell CAP und Serienwiderstand wählt hin und her, bis Sie eine flache Testpuls bekommen. Sie müssen möglicherweise auch Pipette Kapazität FAST CAP Regler einstellen. Schalten Sie% PREDICTION Knopf, um etwa 60-80%, wieder re-Einstellung Whole Cell GAP und der Serienwiderstand dial (Sie müssen eventuell Pipette Kapazität Entschädigung FAST CAP-Knopf als auch einstellen). Schalten Sie% COMP-zu 100% ohne Oszillieren der Zelle, während er versuchte zu halten den Puls flach durch Neueinstellung Whole Cell CAP und Serienwiderstand (Sie müssen eventuell Pipette Kapazität Entschädigung FAST CAP-Knopf als auch einstellen). Stellen Sie die Verzögerung durch eine Verringerung der Zeit konstant. Notieren Sie sich Werte für Cm (Membran-Kapazität), Rs (Vorwiderstand),% COMP, PRED% und Lag Zeit auf den Verstärker in das Notebook gesetzt. Die Cm und Rs sollte etwa die gleiche wie die Cm und Rm in der Membran-Test oben gemessen werden. Schalten Sie externe Lösung Ventil in die Badlösung Kontrolle. Stellen Sie den Verstärker 8-poligen Bessel-Filter bis 2kHz, öffnen Sie ein Voltage-Clamp-Protokoll und beginnt die Aufnahme Ströme. Wir erfassen GIRK Ströme mit einer Rampe Protokoll, das bis -100 mV-Schritten für 50 ms dann Rampen von 100 mV bis +40 mV über 200 ms und ausgeliefert wird alle 2 Sekunden. Die Rampe Protokoll erlaubt die Beobachtung der Umkehr Potential und zur aktiven Korrektur Eigentum GIRK Kanäle. Bei Raumtemperatur (22-25 ° C), die GIRK Strom sollte in der Nähe reverse -50 mV (mit 20 mM KCl in der Badewanne), die in der Nähe der berechneten Gleichgewichtspotential für K (E K = -50 mV) ist, dann bleiben ziemlich flach bei Potentialen positiv zu E K. Experimentelles Protokoll: Nach der Aufzeichnung einer stabilen Basislinie, zur Lösung 20K + Carbachol Schalter und warten Höhepunkt Reaktion, wechseln Sie wieder auf 20K Badlösung, dann gelten 20K + Ethanol und warten Peak-Ansprechen, dann 20K Badlösung Schalter, und schließlich 20K + Ba 2 +-Lösung. Während der Anwendung dieser Medikamente sehen Sie Änderungen in der Amplitude GIRK Ströme (die meisten bei -100 mV ausgesprochen). Beachten Sie die Trace-Nummer entsprechend der Anwendung der unterschiedlichen extrazellulären Lösungen in das Notebook. Ein einziger Clampfit Datei enthält alle Sweeps für die gesamte Experiment. 5. Data Analysis Wir verwenden Clampfit 9.2 Software, um Daten GIRK Ströme bei -100 mV zu analysieren. Öffnen Sie die Datei mit der Aufzeichnung, set cursor bei -100 mV. Standardmäßig finden Sie alle Spuren auf dem Bildschirm überlagert. Durch Drücken von "Write-Cursor"-Symbol erstellen Sie Excel-ähnliche Tabellenkalkulation mit numerischen Daten. Durch die Zuordnung X, um die Trace-Nummer Spalte und Y, um den Cursor-Spalte und Drücken von "Create Graph"-Symbol schnell zurückgreifen kann eine Zeit-Gänge-Plot des Experiments. Berechnen basalen Strom, der durch Subtraktion in Anwesenheit von Ba 2 + Strom aus Strom im externen Perfusionslösung allein ("20K aktuellen" minus "20K + Ba 2 + current") aufgezeichnet. Berechnen induzierten Ströme durch Subtraktion basalen Strom in 20K aus dem aktivierten Ströme ("20K + Carbachol aktuellen" minus "20K aktuellen"; "20K + Ethanol aktuellen" minus "20K current"). Berechnen Sie die Stromdichte (pA / pF), indem der Strom durch Membran Kapazität (direkt aus dem Verstärker eingelesen). Berechnen Prozent Aktivierung, indem induzierten Ströme durch basale Ströme und mit 100 multipliziert. 6. Repräsentative Ergebnisse Sie sollten in der Lage sein Datensatz aus Zellen mit Wildtyp-Kanäle transfizierten Strom. Für GIRK Kanälen messend in der extrazellulären Lösung mit 20 mM K + (und 145 mM K + intrazellulären) sollten sie stark nach innen Berichtigung und eine Umkehr Potenzial von ~ -50 mV, die eine wesentliche Eigenschaft von Kalium-Kanälen ist zu zeigen. Die Wildtyp-Strom stark ansteigen auf Carbachol Anwendung (3-5 mal mehr basalen Strom) und reagieren ähnlich wie die 100 mM Ethanol. Hinweis: das Zeichen Konvention für Elektrophysiologie ist, dass nach innen gerichteten Strom negativ ist und nach außen laufenden positiv ist. Für die L257W-Mutation in der Alkohol-Bindungstasche von GIRK2, werden Sie abgeschwächte Reaktionen sowohl Carbachol und Ethanol zu sehen. Dies deutet darauf hin, dass L 257 in Alkohol und G-Protein-Aktivierung GIRK2 Kanäle beteiligt ist. Weitere Beispiele für die Ergebnisse der GIRK2 Mutagenese, siehe jüngste Veröffentlichung von Aryal et al. 1. Abbildung 1. Window of Clampfit 8,0 zeigt die Daten-Datei für Wildtyp-GIRK2 Aufnahme. Obere linke Tafel zeigt überlagert fegt in Reaktion auf eine Rampenspannung Protokoll in Gegenwart von verschiedenen externen bah-Lösungen erfasst. Cursor 1 ist bei -100 mV positioniert. Die Cursor-Werte sind, um die Tabelle (rechts) geschrieben. Untere linke Tafel zeigt das Diagramm der Sweep Anzahl vs, Strom. Notieren Sie sich die Zunahme des Stroms (Auslenkung nach unten) mit Ethanol (EtOH) und Carbachol (Carb) und Strom-Hemmung mit Ba 2 +. Abbildung 2. Window of Clampfit 8,0 zeigt die Daten-Datei für eine Mutante GIRK2-L257W Aufnahme. Beschreibungen sind die gleichen wie in Abbildung 1. Beachten Sie den Verlust von Carbachol (Carb) Aktivierung und Reduktion von EtOH-induzierte Ströme in der Mutante Kanäle.
