의 입식 이미징 Drosophila 태아

1. 이미징 방법론 그것은 동질적인 액체 될 때까지 20~30분을위한 55 ° C 학위 물 목욕에 젤리 글리세린을 용융. 소용돌이하지만, 거품의 형성을 피하기 위해 병을 흔들지 마세요. 젤리가 녹으 동안 깨끗한 유리 슬라이드 (옵션)에 Kimwipe를 사용하여 글리세롤의 얇은 레이어를 적용합니다. 녹은 글리세린의 피펫 1-1.5 ML 젤리 얇은 첫번째 레이어를 만들려면 슬라이드의 표면에 상처의 P1000의 피펫 팁을 사용합니다. 거품을 피하기 위해 조심스럽게 피펫. 젤리가 수평 표면에 5 분 후, 5 분 -20 ° C에서 슬라이드를 장소와 배아 정렬로 이동합니다 고체화하자. 또는 사란 랩과 슬라이드를 커버하고 최대 5 일 4 ° C에서 그것을 놓으십시오. 젤리 침구의 측면에 70 % 글리세롤 / PBS 또는 기타 antifade 글리세롤 기반 설치 미디어 (예 : Slowfade 또는 Vectashield)의 스테인드 배아의 작은 방울 피펫. 개별적으로 젤리 표면에있는 드롭에서 그들을 전송하여 배아를 미리 정렬 시작합니다. 숟가락으로 한쪽으로 치우 쳤던 측면을 사용하여 한쪽으로 치우 쳤던 피하 바늘을 사용하여 전송합니다. 대략 2-3 열 함께 배아를 놓습니다. 태아가 바늘에 걸리면, 다른 배아 그것을 릴리스가 포함된 드롭에 저어. 신중하게이 시점에서 그들을 정렬 시간을 낭비하지 마십시오. 열 사이에 공간을 둡니다. 피하 바늘의 도움으로 젤리 매체에 수평을 슬라이딩하여 배아를 맞춥니다. 동안 슬라이딩, 방향 같은 방향으로 머리와 꼬리. 열에 따라 서로 그들이 평행합니다. 뒤틀린 Kimiwipe의 조각 흔적으로 남아 PBS의 글리세롤의 초과를 제거합니다. 참고 : 초과의 글리세롤이 어려운 잘라 탑재하고, 두 젤리 레이어의 분리의 결과로, 배아는 젤 이내 느슨하게 쌌다도록합니다. 반대로, 너무 글리세롤을 제거하는 건조하고 배아를 평평하게합니다. 배아 (50-150 μL, 정렬 얼마나 많은에 따라 다름)를 통해 젤리의 얇은 레이어를 확산하기 위해 상처 노란색 팁을 사용하십시오. 플레이스 10-20 분 -20 ° C의 냉동고에 슬라이드 또는 4 ° C 야간에 그것을 저장합니다. 젤리가 절단하기 전에 완전히 딱딱한 있는지 확인하십시오. 그렇지 않으면, 배아의 블록 소비세 매우 어려운 것입니다. 절단에 대한 최상의 결과는 그 다음날에 얻을 수 있습니다. 해부 현미경, 정렬 태아의 양쪽에있는 젤리를 통해 완전히 잘라 면도날을 사용합니다. 바로 상처를 만들기 위해 90 ° 각도로 면도날을 잡아. 상처는 이미지를 막지 수 있습니다 여분의 젤리를 피하기 위해 태아의 앞쪽에 및 사후 기둥 매우 가까이하여야한다. 추운 PBT (4 ° C, PBS 0.1 % 트윈 20) 상처 조심스럽게 주걱을 사용하여 태아 사이의 젤리를 긁어 옆에.의 100-200 μL 추가 참고 : PBT의 세제는 배아를 손상하지 않고 슬라이드에서 젤리의 제거를 도와줍니다. 바늘을 사용하여 더욱 절단을위한 깨끗한 슬라이드에 포함된 배아와 젤리의 블록을 전송합니다. 5-7 배아와 작은 블록을 잘라. 쉽게 젤리 블록 이동에 PBT를 사용합니다. 또는, 그것이 필요한 경우 정확하게, 젤리를 트리밍에 대한 더 안정성을 만드는 유리에 부착하도록 건조 유리 표면에 블록을 놓으십시오. 면도날과 바늘의 도움으로 젤리에 포함된 똑바로 배아를 플립. 현미경 시각화 들어, 사용중인 스탠드 현미경의 종류에 따라 아래의 두 단계 중 하나를 진행합니다. 거꾸로 현미경 : 장소가 직립 위치에 태아와, 긴 coverslip에 배아 블록을 완료했다. 젤리의 최소 금액과 함께 배아의 측면이 목적으로 가까이 접촉하는 것임을 확인합니다. 입식 현미경 : "지원"으로 사용하고있는 "지원"사이에 글리세롤의 배아 블록을 배치하는 superglue와 붙어 네 # 1 coverslips 두 개의 스택을합니다. 긴 coverslip을 사용하여 스택을 다리. 공촛점 분석을 위해, 확인하는 데 사용할 목적의 작업 거리를 확인해 이미지 배아를 통해 모든 방법을하거나 일부만 여부. 예를 들어, D. melanogaster의 배아는 길이 ~ 0.55 mm을 가지고 전적으로 자이스 혈구 20x 계획 – APO 또는 40x LD 네오 플루어 목표를 사용하여 몇 군데하실 수 있습니다. 다음 웹 사이트를 사용할 수 자이스 혈구의 목표에 대한 정보를 가지고 여러분에게 작업 거리에 따라 목표를 검색할 수있는 옵션을 제공합니다 : https://www.micro-shop.zeiss.com/us/us_en/objektive.php을 2. 대표 결과 배아가 그대로 유지되기 때문에이 방법은 태아의 크기와 유전자 발현 패턴 사이의 거리의 정확한 측정을하는 데 사용할 수 있습니다. 그림 1에서, 우리는 핵 얼룩 DAPI (파란색), 안티 도설 단백질 (적색), SOG의 mRNA (노란색)와 SNA의 mRNA (녹색)와 스테인드 배반엽 스테이지 배아를 보여줍니다. 형태학의 procesSES, mesoderm의 invagination (그림 2A, B)와 mesodermal 세포 (그림 3 및 4)의 마이 그 레이션 등도이 방법을 사용하여 시각하실 수 있습니다. DV의 축을 따라 다른 Z – 위치가 같은 그림 2-4과 같이 초점 비행기를 변경하여 얻을 수 있습니다. 그림 1. 배반엽 단계에 손상 배아의 직립 광학 조각. mRNA와 단백질에 대한 이중 염색법. 현장 프로브의 (SOG 및 SNA)과 기본 항체 (안티 도설)의 스테인드 단백질에 대한 대상 mRNAs는 그림 표시됩니다. DAPI는 핵 레이블에 사용되었습니다. 도설의 표현이 핵 동안 SOG와 SNA의 표현이, 세포질에 apically 위치됩니다. 핵에 위치하고 있습니다 SOG 초기 성적에서 강한 신호도이 확대에서 볼 수 있습니다. 그림 2. 손상 gastrulating 배아의 직립 영상. mRNA 프로브는 사용하고 각각의 색상은 그림 표시됩니다. A)이 단계에서, 세 유전자 같은 플루어 (녹색 SNA, SOG 및 dpp)와 스테인드합니다이 공간 분리 도메인에서 표현됩니다. invaginating mesoderm은 SNA를 표현, neuroblast 계층이 산업을 표현하고 SOG의 표현은 여전히 신경 시스템의 복부 지역에있는 동안 ectoderm은 dpp를 표현합니다. B) 같은 배아의 깊이 공촛점 비행기, 우리는 강하게 SNA을 표현 invaginating mesoderm의 기반을 참고하지만, 그 꼭대기의 지역은 낮은 수준을 표현하고 있습니다. 그림 3. . 달팽이, 산업 및 dpp의 mRNAs (녹색), 도설 단백질 (빨간색), 세균 밴드와 손상 배아의 입식 영상은 SOG RNA (노란색)을 확장. 핵은 DAPI (파란색)와 스테인드되었습니다. 배아의 머리 근처) 초점 비행기. 같은 배아의 트렁크 지역에서 B) 또 다른 초점 비행기. 세균 밴드 확장 배아의 양쪽에 가까운 복부 정중선 거짓말하는 측면 마이 그 레이션하기 전에 mesodermal 세포 (4 그림과 비교할 때)의 참고 질량. Delaminating neuroblasts는 녹색 (산업 및 SNA)에 표시됩니다. 그림 4. 세균 대역 확장하는 동안 손상 배아의 입식 이미징 SOG RNA (노란색). 달팽이, 산업 및 dpp의 mRNAs (녹색), 도설 단백질 (빨간색). A), 상피 (화살표)에서 delaminating neuroblasts 참고이 단계 (녹색)에서 산업 및 SNA에 대해 모두 스테인드. SOG의 제한된 표현은 배면의 정중선 (노란색) 또한 있습니다. 이 단계에서 dpp 표현은 배아 (별표)의 측면 양쪽에서 볼 수 있습니다. B) 같은 배아의 광학 섹션 중순 후부 지역에 해당하는 배아 길이의 끝 부분에 표시됩니다. 복부 정중선 세포가 SOG를 위해 얼룩이 있습니다.