Imaging verticale di Drosophila Embrioni

1. Metodologia di imaging Melt glicerina gelatina in un bagno d'acqua ° 55 ° C per 20-30 minuti fino a quando diventa un liquido omogeneo. Ricciolo, ma non agitare la bottiglia per evitare la formazione di bolle. Mentre la gelatina si scioglie, applicare un sottile strato di glicerolo con un Kimwipe su un vetrino pulito (opzionale). Pipettare 1 a 1,5 ml di glicerina gelatina sciolta con un P1000 punta tagliata della pipetta sulla superficie del vetrino per creare un sottile strato prima. Pipettare con attenzione per evitare bolle. Lasciate che la gelatina solidificare per 5 minuti su una superficie orizzontale, poi posto la diapositiva a -20 ° C per 5 minuti e procedere con l'allineamento degli embrioni. In alternativa, coprire il vetrino con pellicola trasparente e mettetelo a 4 ° C per un massimo di 5 giorni. Pipettare una piccola goccia di embrioni macchiato nel 70% glicerolo / PBS o altri mezzi di montaggio Antifade glicerolo-based (ad es Slowfade o Vectashield) sul lato del letto gelatina. Iniziare pre-allineamento degli embrioni da parte individualmente di trasferirli dal menù alla superficie gelatina. Trasferirli usando un ago ipodermico inclinato, usando il lato inclinato come un cucchiaio. Circa posto gli embrioni lungo 2-3 colonne. Se un embrione si blocca in dell'ago, questo aggiungete la goccia contenente gli embrioni altri per rilasciarlo. Non perdere tempo con cura allineando a questo punto. Lascia un pò di spazio tra le colonne. Allineare gli embrioni facendo scorrere orizzontalmente sul supporto gelatina con l'ausilio dell'ago ipodermico. Facendo scorrere, orientare le teste e le code nella stessa direzione. Rendili parallele tra loro lungo la colonna. Rimuovere l'eccesso di glicerolo PBS lasciato come una scia con un pezzo di Kimiwipe contorto. Nota: glicerolo eccesso causerà embrioni di essere vagamente racchiusi all'interno di gel, con conseguente separazione dei due strati di gelatina, il che rende difficile da tagliare e montare. Al contrario, la rimozione di glicerolo troppo si secca e appiattire embrioni. Utilizzare una punta di giallo tagliato a diffondere un sottile strato di gelatina negli embrioni (50-150 microlitri, a seconda di quanti erano allineati). Porre il vetrino in freezer -20 ° C per 10-20 minuti o conservarlo a 4 ° C per una notte. Assicurarsi che la gelatina è completamente rigido prima del taglio. In caso contrario, il blocco degli embrioni sarà molto difficile da accise. I migliori risultati per il taglio sono ottenuti il ​​giorno successivo. In un ambito di dissezione, usare una lama di rasoio per tagliare completamente attraverso la gelatina su entrambi i lati degli embrioni allineate. Tenere la lama di rasoio in un angolo di 90 ° di effettuare tagli diritti. I tagli dovrebbero essere molto vicino ai poli anteriore e posteriore degli embrioni per evitare eccesso di gelatina che può ostacolare l'imaging. Aggiungere 100-200 ml di freddo PBT (4 ° C, PBS +0,1% Tween 20) accanto ai tagli e con attenzione raschiare la gelatina tra embrioni con una spatola. Nota: Il detersivo in PBT aiuta la rimozione della gelatina dalla diapositiva senza danneggiare gli embrioni. Utilizzando un ago, il trasferimento del blocco di gelatina con embrioni incorporato a un vetrino pulito per il taglio ulteriore. Tagliare i blocchi più piccoli con embrioni 5-7. Usa PBT di muoversi facilmente intorno al blocco di gelatina. In alternativa, posizionare il blocco su una superficie di vetro asciutta per farla attaccare al vetro, che crea una maggiore stabilità proprio per tagliare la gelatina, se necessario. Raddrizzarsi gli embrioni incorporato nel gelatina con l'aiuto di una lama di un rasoio e un ago. Per la visualizzazione al microscopio, procedere con uno dei due passaggi riportati di seguito, a seconda del tipo di microscopio stare in uso. Microscopio invertito: luogo finito blocchi embrione su un vetrino lungo, con gli embrioni in posizione verticale. Assicurarsi che il lato dell'embrione con la minor quantità di gelatina sarà a più stretto contatto con obiettivo. Microscopio verticale: fare due pile con quattro # 1 coprioggetto incollato con colla da utilizzare come "supporto" e posizionare il blocco embrione in glicerolo tra i "supporti". Colmare il pile con un coprioggetto lungo. Per l'analisi confocale, controllare la distanza di lavoro degli obiettivi da utilizzare per sapere se è possibile immagine tutto il percorso attraverso l'embrione o solo parzialmente. Per esempio, D. embrioni melanogaster hanno ~ 0,55 millimetri di lunghezza e possono essere interamente ripreso con un Zeiss 20x Plan-Apo o un 40x LD neo-Fluor obiettivo. Il sito contiene informazioni sui seguenti obiettivi Zeiss disponibili e vi dà la possibilità di ricercare gli obiettivi in ​​base alle distanze di lavoro: https://www.micro-shop.zeiss.com/us/us_en/objektive.php 2. Rappresentante Risultati Perché gli embrioni sono rimasti intatti, questo metodo può essere utilizzato per effettuare misurazioni precise delle dimensioni degli embrioni e distanze tra gli schemi di espressione genica. Nella Figura 1, ci mostrano una embrioni Blastoderm fase colorati con il nucleare macchia DAPI (blu), anti-dorsale delle proteine ​​(rosso), mRNA SOG (giallo) e mRNA sna (verde). Proces morfologicases, come invaginazione del mesoderma (Figura 2A, B) e la migrazione di cellule mesodermiche (Figura 3 e 4) possono anche essere visualizzati utilizzando questo metodo. Z-posizioni diverse lungo l'asse DV può essere ottenuto cambiando il piano focale, come mostrato nelle Figure 2-4. Figura 1. Verticale fetta ottica di un embrione intatto in fase Blastoderm. Colorazione doppia per mRNA e proteine. MRNA bersaglio per le sonde in situ (SOG e SNA) e di proteine ​​colorate con l'anticorpo primario (anti-dorsali) sono indicati in figura. DAPI è stato usato per etichettare i nuclei. Si noti che l'espressione di SOG e SNA si trovano nel citoplasma apicale, mentre l'espressione della dorsale è nucleare. Segnali forti dalle trascrizioni sog nascente che si trovano nei nuclei può essere visto anche in questo ingrandimento. Figura 2. Immagine verticale di un embrione intatto gastrulating. Sonde mRNA usato e loro rispettivi colori sono indicate in figura. A) Si noti che in questa fase, tre geni colorati con lo stesso fluoro (sna, SOG e DPP, in verde), sono espressi in domini separati spazialmente. Il mesoderma invaginating esprime sna, lo strato di neuroblasti esprime ind e l'ectoderma esprime dpp, mentre l'espressione sog è ancora presente nelle regioni ventrale del sistema nervoso. B) In un piano più profondo confocale dell'embrione stesso, si nota la base del mesoderma invaginating esprime fortemente sna, ma la sua regione apicale esprime livelli più bassi. Figura 3. Immagine verticale di un embrione intatto con la band di germe esteso sog RNA (giallo);. Lumaca, ind e mRNA DPP (verde), proteine ​​dorsali (rosso). I nuclei sono stati colorati con DAPI (blu). A) sul piano focale vicino alla testa dell'embrione. B) Un altro piano focale nella regione del tronco dell'embrione stesso. Massa nota di cellule mesodermiche prima della migrazione laterale (confronta con Figura 4) aderente alla linea mediana ventrale su entrambi i lati di un germe-band embrione esteso. Neuroblasti delaminazioni sono etichettati in verde (ind e SNA). Figura 4. Immagine verticale di un embrione intatto durante l'estensione di germe di banda sog RNA (giallo);. Lumaca, ind e mRNA DPP (verde), proteine ​​dorsali (rosso). A) Si noti la neuroblasti delaminazioni dal epitelio (freccia), macchiato sia per ind e SNA in questa fase (verde). Si noti anche l'espressione ristretto di SOG alla linea mediana ventrale (giallo). Espressione di DPP in questa fase può essere visto facce laterali dell'embrione (asterisco). B) sezione ottica nell'embrione stesso mostrato in A verso la fine della lunghezza dell'embrione, che corrisponde alla metà posteriore regione. Le cellule della linea mediana ventrale sono macchiati di sog.