הדמיה של זקופה תסיסנית עוברים
Summary
כאן אנו מציגים פרוטוקול הרכבה מוכתם<em> תסיסנית</em> עוברים בתנוחה זקופה המאפשרת הדמיה של חתכים באמצעות מיקרוסקופ Confocal.
Abstract
מספר ידוע הדרגתיים המוךפו"גנטי שהולך ותנועות הסלולר להתרחש לאורך הציר הגבי / הגחון של<em> תסיסנית</em> העובר. עם זאת, טכניקות הנוכחי נעשה שימוש כדי להציג תהליכים כאלה מוגבלים במקצת. פרוטוקול הבאה מתארת שיטה חדשה הרכבה קבוע שכותרתו<em> תסיסנית</em> עוברים לצפייה העטרה עם הדמיה confocal. שיטה זו כוללת הטבעה העוברים בין שתי שכבות של התקשורת גליצרין ג'לי הרכבה, הדמיה רצועות ג'לי בעמדה זקופה. הצעד הראשון עבור הרבדה העוברים היא להפוך את תשתית דקה של ריבת גליצרין בשקופית. לאחר מכן, עוברים מיושרים בקפידה על משטח זה מכוסה בשכבה השנייה של ג'לי. אחרי השכבה השנייה היא הקרושה, רצועות ג'לי נחתכים והתהפך זקוף הדמיה. חלופות מתוארים עבור לדמיין את העוברים בהתאם לסוג של מיקרוסקופ עומד לשמש. מאז כל התאים לאורך הציר הגבי-הגחון הם צילמו בתוך מטוס-Z יחיד confocal, השיטה שלנו מאפשרת מדידה מדויקת והשוואה של אותות ניאון ללא photobleaching או פיזור אור משותפת 3D שחזורים של עוברים רכוב longitudinally.
Protocol
Discussion
לקיחת תמונות חתך של עוברים תסיסנית יכול להיות מאתגר, כיוון שהיא דורשת דיסקציה זהירה של יד 2 פרוסות או שימוש בתקשורת מוטבע לעיבוד microtome, שהיא בדרך כלל מזיקה עבור stainings ניאון. לחלופין, Z-ערימות שנעשו מיקרוסקופ Confocal ניתן להשתמש כדי להפוך את שיקום 3D של חתך תמונות. עם זאת, זמן רב כדי להפוך כמה פרוסות דק Confocal לשיקום photobleaching 3D מדויק הופכת בעייתית. דאגה נוספת כאשר עוברים הדמיה כי הם רכובים longitudinally הוא פיזור אור המתרחשת כאשר מגיעים חלקים עמוקים יותר של העובר, אשר גם מסבך לקיחת מידות מדויקות של אותות ניאון לצורך כימות של רמות החלבון או ביטוי mRNA 1. אפילו עם מיקרוסקופ שני הפוטונים confocal, פיזור אור עדיין דאגה בגלל האטימות של החומר חלמון באמצע של העובר, מה שהופך את הבחירה של התקשורת הרכבה לשקיפות אופטימלי של המדגם להיות מוגבל.
כדי לעקוף את הבעיות הללו, טכניקה חדשה בשם "סיום על" הדמיה של עוברים מיצוב אנכית פותחה לאחרונה על התמונה הן לחיות דגימות קבוע 4. במאמר זה, פיתחנו פרוטוקול חדש עבור עוברי רכוב אנכית המאפשרת הכנה ויזואליזציה פשוטה של עוברי או רקמות קבוע בכל גודל וצורה, כי הם מוכתמים מספר בדיקות באתרו 3. השיטה שלנו מורכבת של שימוש גובר בתקשורת עם עקביות ג'לטיני המשמש לשים בארגז עוברים מיושר בתוכו. בלוקים Cut זה כלי התקשורת הרכבה ובו עוברים מוטבע ניתן למקם זקוף לפני הדמיה בכל סוג של מיקרוסקופ Confocal.
על ידי הטבעה את העוברים לתוך ג'לי ומיקום אותם במאונך, אנו מסוגלים לקחת אופקי חתכים באמצעות מיקרוסקופ Confocal, שבו תאים לאורך הציר הגבי-הגחון של העובר מוצגים בו זמנית. זהו שיפור משמעותי לצורך כימות מאז בעיות של פיזור אור photobleaching של צבעי ניאון המתרחשת שחזור Z-מחסנית קונבנציונאלי של עוברים רכוב longitudinally מסולקות עכשיו. לפיכך, כימות הביטוי או חלבון רמות הגן לאורך הציר הגבי-הגחון מדויק, שכן התאים הממוקם הגבי-הגחון עמדות מול הם צילמו באותו זמן ובאותו העמדה-Z אותו confocal. בנוסף, בשיטה המתוארת מאפשרת לנו לקבל תמונה מלאה 2-D על פני ציר הגבי-הגחון מעובר 3-D ללא שימוש מורכב שיטות חישוביות ופרש לדמיין תאים בנקודות שונות לאורך ציר DV 6.
כמה שלבים קריטיים לכלול הסרת עודפי גליצרול לאחר יישור עוברים, כדי למנוע פיצול בין שתי שכבות של ג'לי. עם זאת, אם המדגם הוא מיובש מדי, התמונה המתקבלת יהיה מעוות יש מורפולוגיה שגויה. בנוסף, אם המדיום ג'לי סביב העובר נחתך בזווית ולא ישר, וכתוצאה מכך התמונה עשויה להופיע בסיבוב פחות ביצי יותר בכושר, בשל מיקום שגוי של עוברים בזווית שאינה 90 מעלות. לבסוף, אם ג'לי אינו הדוק מספיק כדי לחתוך העובר על קצות קדמית / אחורית, לא ניתן לקבל תמונה נכונה בגלל מרחק העבודה של מטרה ישמש בעיקר כדי להתמקד לתוך ג'לי ולא את העובר.
צעד חשוב נוסף אשר עשוי להיות נחוץ כאשר העובר מאוחר הדמיה gastrulating היא בזהירות למיין את שלבי עניין תחת היקף לפני ליישר אותם. בדרך כלל, עוברים הם מבוימים על פי מאפיינים מורפולוגיים, כי ניתן לזהות בקלות כאשר בעמדה האורך.
בין השינויים אלטרנטיבה שיכולה להתבצע בשיטה זו היא לכלול מגיב אנטי לדעוך (למשל p-Phenylenediamine או PPD) לתוך השכבה השנייה של ג'לי כדי לסייע בהגנה מפני photobleaching של צבעי ניאון.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
המחברים הם אסיר תודה באופן מיוחד דבורה האריס דניאל מק 'קיי. תמיכה עבור עבודה זה סופק על ידי המחלקה לביולוגיה במכללה לאמנויות ומדעים של CWRU, ועל ידי מספר מענק HHMI 52005866 לתמיכה של חינוך לתואר ראשון במדעים ביולוגיים.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Glycerin Jelly mounting media | Electron Microscopy Sciences Company | 17998-10 | Contains low concentration of phenol as preservative and should be used in hood or in well ventilated area. Recipe for making your own media is described in Zander, 1997. | |
| Zeiss LSM 700 Confocal | Zeiss | The following objectives were used: Plan-Apo 20x 0.8 M27 (WD 0.55mm); EC Plan-Neofluar 40x 1.3 oil (WD 0.21mm); LD Plan-Neofluar 0.6 Korr 40X (WD 2.9mm). | ||
| Phosphate buffered saline with 0.1% Tween 20 (PBT) | ||||
| Glass microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-7 | ||
| Glass cover slips | Electron Microscopy Sciences | 72204-02 | Size 1 ½ (specific for the objectives used in this work). | |
| Glass cover slips (for making supports) | Fisherfinest | 12-544-10 | Use four coverslips glued with superglue. | |
| Dissection microscope | M5 Wild Heerbrugg Wild Makroskop | M420 | ||
| Razor blade | Steel back single edge industrial blades | |||
| Spatula | Fisher | 21-401-10 | ||
| Hypodermic needles | Fisher | 1482610 | 26 Gauge | |
| Pipettes | Labnet |
References
- Ay, A., Fakhouri, W. D., Chiu, C., Arnosti, D. N. Image processing and analysis for quantifying gene expression from early Drosophila embryos. Tissue Engineering. 14, 1517-1526 (2008).
- Grβhans, J., Wieschaus, E. A genetic link between morphogenesis and cell division during formation of the ventral furrow in Drosophila. Cell. 101, 523-531 (2000).
- Kosman, D., Mizutani, C. M., Lemons, D., Cox, W. G., McGinnis, W., Bier, E. Multiplex detection of RNA expression in Drosophila embryos. Science. 305, 846-846 (2004).
- Witzberger, M. M., Fitzpatrick, J. A. J., Crowley, J. C., Minden, J. S. End-on imaging: a new perspective on dorsoventral development in Drosophila embryos. Developmental Dynamics. 237, 3252-3259 (2008).
- Zander, R. H. On mounting delicate bryophytes in glycerol. The Bryologist. 100, 380-382 (1997).
- Liberman, L. M., Reeves, G. T., Stathopoulos, A. Quantitative imaging of the Dorsal nuclear gradient reveals limitations to threshold-dependent patterning in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (52), 22317-2222 (2009).
