تستقيم تصوير ذبابة الفاكهة الأجنة
Summary
هنا نطرح على بروتوكول لتصاعد الملون<em> ذبابة الفاكهة</em> الأجنة في وضع رأسي يسمح التصوير من المقاطع العرضية باستخدام المجهر متحد البؤر.
Abstract
عدة معروفة تخلقية التدرجات والحركات الخلوية يحدث على طول المحور الظهري / البطنية من<em> ذبابة الفاكهة</em> الجنين. ومع ذلك ، فإن التقنيات الحالية المستخدمة لعرض مثل هذه العمليات محدودة نوعا ما. بروتوكول التالية توضح تقنية جديدة لتركيب ثابت والمسمى<em> ذبابة الفاكهة</em> أجنة للعرض مع التصوير مبائر الاكليلية. يتكون هذا الأسلوب من تضمين الأجنة بين طبقتين من وسائل الاعلام هلام الغليسرين المتصاعدة ، وشرائط التصوير هلام المتمركزة في وضع مستقيم. الخطوة الأولى ليقحم الأجنة هو جعل الفراش رقيقة من هلام الغليسرين على شريحة. المقبل ، يتم محاذاة الأجنة بعناية على هذا السطح ، ومغطاة بطبقة ثانية من جيلي. بعد توطد الطبقة الثانية ، يتم قطع شرائح من هلام وانقلبت تستقيم للتصوير. موصوفة بدائل لتصور الأجنة تبعا لنوع من الوقوف المجهر لاستخدامه. حيث يتم تصوير كل الخلايا على طول المحور الظهري البطني داخل احد مبائر Z – الطائرة ، لدينا وسيلة تسمح للقياس والمقارنة الدقيقة للإشارات الفلورسنت دون تشتت الضوء أو photobleaching مشتركة لإعادة بناء 3D الأجنة التي شنت طوليا.
Protocol
Discussion
يمكن التقاط صور المقطع العرضي للأجنة ذبابة الفاكهة يمكن أن يكون تحديا ، لأنه يتطلب إما تشريح دقيق لجهة شرائح 2 أو استخدام وسائل الإعلام جزءا لا يتجزأ من لتجهيز مشراح ، التي عادة ما تكون مضرة لstainings الفلورسنت. بدلا من ذلك ، يمكن استخدام Z – مداخن المحرز في متحد البؤر المجهر لجعل إعادة الإعمار 3D عبر قسم الصور. ومع ذلك ، فإنه يستغرق وقتا طويلا لجعل عدة شرائح رقيقة متحد البؤر لإعادة الإعمار و 3D دقيقة وphotobleaching يصبح إشكالية. مصدر آخر للقلق عند الأجنة التصوير التي تقام طوليا هو تشتت الضوء الذي يحدث عند الوصول إلى أعمق أجزاء من الجنين ، مما يعقد أيضا أخذ قياسات دقيقة للإشارات الفلورسنت لغرض تقدير مستويات بروتين تعبير أو مرنا 1. حتى مع وجود مجهر ثنائي الفوتون مبائر ، تشتت الضوء لا يزال مصدر قلق نظرا لغموض المادة صفار في منتصف الجنين ، مما يجعل اختيار وسائل الإعلام عن تزايد الشفافية المثلى من العينة أن تكون محدودة.
للتحايل على هذه المشاكل ، وهي تقنية جديدة تسمى "النهائي على" تصوير الأجنة المواقع عموديا وضعت مؤخرا لصورة كل من يعيش وعينات ثابتة 4. في هذه الورقة ، قمنا بتطوير بروتوكول جديد للأجنة عموديا الذي يسمح لإعداد تصور بسيط وثابت للأجنة أو أنسجة من أي حجم والشكل الذي هي ملطخة تحقيقات متعددة في الموضع 3. تتكون لدينا وسيلة لاستخدام وسائل الإعلام مع تصاعد الاتساق هلامي التي تستخدم لمحاذاة يغلف الاجنة في داخلها. يمكن وضع قطع من كتل هذه الوسائط التي تحتوي على أجنة متزايدة جزءا لا يتجزأ من تستقيم قبل التصوير في أي نوع من متحد البؤر المجهر.
عن طريق تضمين الأجنة في هلام ووضعهم عموديا ، ونحن قادرون على اتخاذ المقاطع العرضية الأفقية باستخدام المجهر متحد البؤر ، والتي تعرض الخلايا على طول المحور الظهري البطني للجنين في وقت واحد. هذا هو تحسنا كبيرا منذ لأغراض القياس الكمي مشاكل تشتت الضوء وphotobleaching من الأصباغ الفلورية التي تحدث في إعادة الإعمار Z – المكدس التقليدية للأجنة التي شنت طوليا يتم القضاء الآن. وهكذا ، القياس الكمي لمستويات التعبير الجيني أو البروتين على طول المحور الظهري البطني غير دقيقة ، حيث يتم تصوير الخلايا الموجودة في مواقع الظهري البطني العكس في نفس الوقت وعلى نفس مبائر Z – الموقف. بالإضافة إلى ذلك ، وصف الأسلوب يتيح لنا الحصول على كامل 2 – D صورة عبر المحور الظهري البطني من جنين 3 – D من دون استخدام أساليب معقدة تتفتح الحسابية لتصور خلايا في مواقع مختلفة على طول المحور DV 6.
بعض الخطوات الهامة تشمل إزالة الزائدة بعد الجلسرين محاذاة الأجنة ، لتجنب الانقسام بين طبقتين من جيلي. ومع ذلك ، إذا كانت العينة المجففة جدا ، فإن الصورة الناتجة تكون ممسوخ والتشكل وغير صحيحة. بالإضافة إلى ذلك ، إذا تم خفض متوسط هلام حول الجنين في زاوية مستقيمة بدلا من ذلك ، قد تظهر الصورة الناتجة أقل المستديرة وأكثر في شكل البيضة ، ويرجع ذلك إلى وضع غير صحيح من الأجنة في زاوية أخرى من 90 درجة. أخيرا ، إذا لم يتم خفض هلام عن كثب بما فيه الكفاية لالجنين على نهايات الأمامي / الخلفي ، فإنه ليس من الممكن الحصول على صورة مناسبة لأن تكون المسافة الهدف يعمل تستخدم أساسا للتركيز في هلام وليس الجنين.
خطوة هامة أخرى قد تكون ضرورية عند تصوير الجنين في وقت متأخر gastrulating هو فرز دقيق للمراحل ضمن نطاق الاهتمام قبل مواءمتها. عادة ، يتم وفقا لنظم الأجنة الصفات المورفولوجية التي يمكن بسهولة المعترف بها عندما تكون في وضع يمكنها الطولية.
من بين التعديلات البديلة التي يمكن إجراؤها مع هذا الأسلوب هو كاشف لتشمل مكافحة تتلاشى (على سبيل المثال ف Phenylenediamine أو PPD) في الطبقة الثانية من هلام للمساعدة في حماية ضد photobleaching من الأصباغ الفلورية.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
الكتاب مدينون بشكل خاص لهاريس وديبورا ماكاي دانيال. وقدم الدعم لهذا العمل من قبل دائرة علم الأحياء وكلية الآداب والعلوم CWRU ، وعبر منح عدد HHMI 52005866 لدعم التعليم الجامعي في مجال العلوم البيولوجية
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Glycerin Jelly mounting media | Electron Microscopy Sciences Company | 17998-10 | Contains low concentration of phenol as preservative and should be used in hood or in well ventilated area. Recipe for making your own media is described in Zander, 1997. | |
| Zeiss LSM 700 Confocal | Zeiss | The following objectives were used: Plan-Apo 20x 0.8 M27 (WD 0.55mm); EC Plan-Neofluar 40x 1.3 oil (WD 0.21mm); LD Plan-Neofluar 0.6 Korr 40X (WD 2.9mm). | ||
| Phosphate buffered saline with 0.1% Tween 20 (PBT) | ||||
| Glass microscope slides | Fisher Scientific | 12-544-7 | ||
| Glass cover slips | Electron Microscopy Sciences | 72204-02 | Size 1 ½ (specific for the objectives used in this work). | |
| Glass cover slips (for making supports) | Fisherfinest | 12-544-10 | Use four coverslips glued with superglue. | |
| Dissection microscope | M5 Wild Heerbrugg Wild Makroskop | M420 | ||
| Razor blade | Steel back single edge industrial blades | |||
| Spatula | Fisher | 21-401-10 | ||
| Hypodermic needles | Fisher | 1482610 | 26 Gauge | |
| Pipettes | Labnet |
References
- Ay, A., Fakhouri, W. D., Chiu, C., Arnosti, D. N. Image processing and analysis for quantifying gene expression from early Drosophila embryos. Tissue Engineering. 14, 1517-1526 (2008).
- Grβhans, J., Wieschaus, E. A genetic link between morphogenesis and cell division during formation of the ventral furrow in Drosophila. Cell. 101, 523-531 (2000).
- Kosman, D., Mizutani, C. M., Lemons, D., Cox, W. G., McGinnis, W., Bier, E. Multiplex detection of RNA expression in Drosophila embryos. Science. 305, 846-846 (2004).
- Witzberger, M. M., Fitzpatrick, J. A. J., Crowley, J. C., Minden, J. S. End-on imaging: a new perspective on dorsoventral development in Drosophila embryos. Developmental Dynamics. 237, 3252-3259 (2008).
- Zander, R. H. On mounting delicate bryophytes in glycerol. The Bryologist. 100, 380-382 (1997).
- Liberman, L. M., Reeves, G. T., Stathopoulos, A. Quantitative imaging of the Dorsal nuclear gradient reveals limitations to threshold-dependent patterning in Drosophila. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (52), 22317-2222 (2009).
