Выделение стволовых клеток из прав ксенотрансплантаты рака поджелудочной железы

1. Урожай ксенотрансплантаты от мышей Подготовка клеточной диссоциации буфера: Дульбеко изменение Eagle среды (DMEM) с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FCS), пенициллин-стрептомицина, 200 ЕД / мл коллагеназы типа IV, и 0,6 Ед / мл dispase. Athymic (ню + / ню +) мыши укрывательство подкожной человека ксенотрансплантата раком поджелудочной железы, что составляет менее 1 см в наибольшем диаметре усыпляют углекислым газом удушья и шейки дислокации. Опухоль подкожной собирается с фланга мыши, тупой диссекции использованием щипцы и ножницы и располагаться непосредственно в буферной клеточной диссоциации. Опухоли взвешивали и помещали обратно в 10 мл клеточной диссоциации буфер на 1 грамм ткани опухоли. 2. Создание Одноклеточный Отстранение от ксенотрансплантаты Работа в стерильных биобезопасности кабинет, опухоль переходит к 100 х 20 мм культуры блюдо с 1 мл буфера клеточной диссоциации. Опухоли механически измельченного стерильные лезвия бритвы и пинцета. Суспензии клеток опухоли растирают через 5-мл серологические пипетки в 10 раз. Опухоль части должны быть достаточно маленькими, чтобы не засорять 5-мл серологические пипетки. Опухоль суспензии клеток передается в 50-мл коническую трубку с остальной объем клеточной диссоциации буфер (заполнены менее чем на 50%) и перемешивали при максимальной скорости в течение 1 минуты. Опухоль суспензии клеток, затем инкубировали при 37 ° С в течение 2 часов с прерывистым вортексе в течение 1 минуты каждые 20 минут. 3. Разрушающих клеточную суспензию из тканей мусора и мертвых клеток После 2-часовой инкубации суспензии клеток является встряхивали при максимальной скорости в течение 1 минуты. Клеточной суспензии затем проходит через 70-мкм фильтр и собрали в свежем 50-мл коническую трубку и доводят до конечного объема 15 мл на трубе. Для дальнейшего отдельных жизнеспособных клеток от мертвых клеток и тканей мусора, опухоли клеточной суспензии отделяется плотности центрифугирования использованием Ficoll-Paque Plus. Подстилающего слоя из Ficoll-Paque Plus создан pipeting 15 мл Ficoll-Paque Плюс медленно ниже клеточной суспензии стараясь не смешивать два слоя. Суспензии клеток и Ficoll слои центрифугируют при 500x г в течение 30 минут с тормоза выключены. Клетки на стыке Ficoll-Paque Plus и клеточной диссоциации буфера собраны и переданы в свежем 50-мл коническую трубку. Свежий DMEM с добавлением 10% FCS добавляется к клеточной суспензии для разбавления его 1:3 (например, 20 мл свежего СМИ добавляют к 10 мл клеточной суспензии). Клетки собирали центрифугированием при 450x г в течение 10 минут, СМИ сливают, а осадок клеток ресуспендируют в 1 мл буфера ALDEFLUOR. Десять мкл клеточной суспензии разбавляют 10 мкл трипанового синий и жизнеспособных клеток считаются использованием гемоцитометра. Если большое количество мертвых клеток или тканей мусора отметил во время этого шага, то клетка сепарацию по плотности центрифугирования может быть повторена (шаги 3,3 – 3,7). 4. Пятно Клетки для флуоресценции Активированный сортировки клеток Этикетка семь 12 х 75 мм полистирола пробирки следующим образом: Незапятнанный CD44-APC CD24-PE мышь CD31-биотин + мышь линии-биотин + мышь H-2Kd-биотин ALDEFLUOR ALDEFLUOR + + IgG DEAB 2bκ АПК + IgG 2aκ-PE ALDEFLUOR + CD44-CD24 + APC-PE + мышь CD31-биотин + мышь линии-биотин + мышь H-2Kd-биотин. Развести клеточной суспензии в 2 мл буфера ALDEFLUOR до конечной концентрации в 5-10 млн. кл / мл, а держать на льду. Добавить 100 мкл клеточной суспензии в пробирки № 1, 2, 3, 4 и держать их на льду. Добавить 1 мкл DEAB к трубе № 6 и держать на льду. Добавить ALDEFLUOR реагента к остальным клеточной суспензии разбавляют 1000 – складка (например, добавить 1,6 мкл реагента ALDEFLUOR до 1,6 мл клеточной суспензии), хорошо перемешать и поместить на лед. Передача 100 мкл этой смеси в пробирки № 5 и 6, а оставшуюся смесь (1,4 мл) к трубке № 7. Инкубируйте все трубы в 37 ° С на водяной бане 40 минут. Смешайте клеточной суспензии каждые 10 минут, чтобы предотвратить клетки от оседания на дно трубы. Центрифуга клеток 450x г и 4 ° С в течение 10 минут, затем перелить в буфер. Ресуспендируют гранул в пробирках № 1 и 5 в 100 мкл буфера ALDEFLUOR. Для труб № 2, 3, 4 и 6, добавьте 100 мкл буфера, содержащего ALDEFLUOR соответствующих антител разбавленный следующим образом: 1:20 для IgG 2bΚ АПК, IgG 2aΚ-PE, CD44-APC и CD24-PEантител; 1:100 для мыши CD31-биотин, мыши линии-биотин и мышь H-2Kd-биотин антител. Чтобы трубка № 7 добавить 1,4 мл буфера, содержащего ALDEFLUOR 1:20 разбавление CD44-APC и CD24-PE антитела и 1:100 разбавление мыши CD31-биотин, мыши линии-биотин и мышь H-2Kd-биотин антител. Инкубируйте клеточные суспензии на льду в течение 10 минут. Центрифуга клеток 450x г и 4 ° С в течение 10 минут, затем перелить в буфер. Ресуспендируют гранул в тубах № 1, 2, 3, 5 и 6 в 100 мкл буфера ALDEFLUOR. Подготовка 1,5 мл буфера, содержащего ALDEFLUOR 1:100 разведение стрептавидин-PerCP белка. Добавить 100 мкл в трубку № 4 и добавить 1,4 мл в пробирку № 7. Инкубируйте клеточные суспензии на льду в течение 10 минут. Центрифуга клеток 450x г и 4 ° С в течение 10 минут, затем перелить в буфер. Ресуспендируют гранул в тубах № 1, 2, 3, 4, 5 и 6 в 200 мкл буфера ALDEFLUOR. Ресуспендируют гранул в трубе № 7 в 2,8 мл буфера, содержащего ALDEFLUOR 2 мкг / мл пропидий йодида. Хранить трубы на льду во все времена. Pass клеток через 35-мкм фильтр, используя 12 х 75 мм трубы полистирола тест с колпачками сито. 5. Изолировать стволовые раковые клетки путем флуоресцентной Активированный сортировки клеток Цитометр FACSAria поток готов к сортировки клеток. Компенсация контроля устанавливаются с использованием клеток из труб № 1, 2, 3, 4 и 5. Гейтс создаются на основе передового и бокового разброса параметров ячейки для сбора майки. Номера для мыши (PerCP-отрицательные) и жизнеспособного (не пропидий йодида окрашенных) клетки закрытого использовании FL-3 канала. ALDH + клеток собираются на основе ворота созданные с помощью DEAB-обработанных клеток (труба № 6) и FL-1 канал. CD44 + CD24 + клетки собираются на основе ворота созданы с использованием клеток, окрашенных ALDEFLUOR, IgG 2bΚ АПК и IgG 2aκ-PE (труба № 6) с помощью FL-4 и FL-2 каналов. Клетки собраны в 12 х 75 мм полистирола пробирки с 1 мл DMEM с добавлением 10% FCS. После клетки были отсортированы, центрифуги клеточной суспензии в 450x г в течение 10 минут, сцедить СМИ, и ресуспендирования клеток в 500 мкл свежей DMEM с добавлением 10% FCS. Подсчитайте количество клеток с использованием сортируются гемоцитометра как описано в пункте 3.8. 6. Представитель Результаты Этот протокол приведет к изоляции ALDH + и CD44 + CD24 + CSCS поджелудочной железы. Процент мыши клеток, полученных является переменной величиной, но мы обнаружили, что большинство человеческих ксенотрансплантаты рака поджелудочной железы содержат 20-60% мышей клеток, полученных с помощью мыши CD31, мыши линии коктейль, и мышь H-2Kd биотин-конъюгированных антител (рис. 1А ). Также частота каждой группы населения, CSC из разных ксенотрансплантаты является переменной величиной, но в целом мы обнаружили, что 1-4% от общей численности населения ячейка ALDH + (рис. 1b) и 0,2-5% является CD44 + CD24 + (рис. 1в). Мы регулярно вручную подсчет клеток с использованием сортируются гемоцитометра поскольку рассчитывает FACSAria машины часто неверно из-за непористые частицы обнаружены FACSAria. Рисунок 1. Участок Проточная цитометрия изображением конкретных групп населения от ксенотрансплантата раком поджелудочной железы. (А) Клетки окрашивания положительно в FL-3 канал (пропидий йодид +, CD31 + мышь мышь линии +, или мышь H-2Kd +) исключаются таким образом, чтобы выделить только жизнеспособным и не мышь клеток, полученных из. (B) ALDH деятельности в человеческой ксенотрансплантата раком поджелудочной железы была измерена с помощью проточной цитометрии с использованием реагента ALDEFLUOR в присутствии и в отсутствие ингибитора ALDH1 диэтиламино-бензальдегид (DEAB). Кадры представляют собой ворота, которые изображают ALDH + клеток, которые были созданы на основе клеток, обработанных DEAB, а затем применяются с необработанными клетками. Процент клеток ALDH + приведены в ворота. (C) CD44 + CD24 + ворот был создан на основе клеток, окрашенных ALDEFLUOR и IgG 2bκ АПК (изотипического контроля за CD44-APC) и IgG 2aκ-PE (изотипического контроля за CD24-PE) антител. Процент CD44 + CD24 + клетки приведены в ворота.