Синий Родные электрофореза в полиакриламидном геле (BN-PAGE) для анализа Multiprotein Комплексы из ячеистого Лизаты

** Это видео протокол основан на связанный публикации 1: Голубые Родные электрофореза в полиакриламидном геле (BN-PAGE) для идентификации и анализа Multiprotein комплексов. Махима Свами, Габриэль М. Siegers, Susana Minguet, Бернд Wollscheid и Вольфганг WA Schamel. STKE Науки 2006 (345): pl2 25 июля 2006 года [DOI: 10.1126/stke.3892006pl4]. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть эту публикацию . 1. Подготовка диализу лизат ячейки Урожай 10х10 6 клеток и гранул центрифугированием при 350g в течение 5 мин при 4 ° C. Промыть осадок клеток в три раза с 1 мл ледяной PBS (рецепт 1), центрифуги, как в пункте 1.1. Ресуспендируют осадок в 250 мкл ледяной БН-лизирующего буфера (рецепт 2) и инкубировать на льду в течение 15 мин. Центрифуга при 13000 г в течение 15 мин при 4 ° С для удаления нерастворимого материала. Растопить отверстие в крышке 1,5-мл микроцентрифужных трубки использованием подогревом большой стороны диаметр пипетки Пастера, затем поместите трубку на лед для охлаждения до 4 ° C. Передача супернатант с шага в 1,4 охлажденной трубки с отверстием в крышке. Место диализных мембран (молекулярная масса отсечки 10 кДа) щипцами сверху открыл трубу, закройте крышку, и отсек избыток мембран диализа, что торчит. Уплотнение крышки на стороне тщательно парафильмом. Обратить труб и центрифуги вверх дном на минимальной скорости возможно в 50-мл конические пробирки в центрифугу культуре клеток в течение 10 сек при 4 ° C. Удалить перевернутая трубка из центрифуги с помощью пинцета, чтобы избежать превращения стороне трубки право. Подготовка 100-мл стакан с холодной диализа БН-буфера (рецепт 3) и мешалки. Используйте как минимум 10 мл БН-диализа Буфер на 100-мкл образца. Прикрепите трубку с лентой вверх-вниз внутри стакана, и удалить пузырьки воздуха из отверстия под крышкой использованием изогнутых пипетки Пастера. Место стакан поверх магнит мешалки, включите мешалку и оставить на 6 часов или на ночь в холодной комнате. Проверьте иногда, чтобы обеспечить перемешивание не создавая воздушных пузырей на диализе мембраны. Сбор диализу лизат ячейки в новой охлажденной трубки микроцентрифужных. 2. Заливка БН-гели Градиент заливки геля происходит при комнатной температуре с градиентом смесителя. Перчатки необходимо надевать, потому полиакриламидном очень нейротоксическое. Избегайте контактов с SDS. Место градиент миксером на мешалки и приложите его к кусок гибкого шланга. Закрыть канал с помощью клапана и закройте трубки с зажимом. Место магнитной мешалкой 15% в "высокий" цилиндр связан с трубкой. Тема гибкий шланг в peristalitic насоса и присоединить иглу шприца до конца. Затем поместите иглу между двумя стеклянными пластинами гель аппарата. Подготовка 4% (рецепт 5) и 15% (рецепт 6) разделения гель решения, добавив, APS и TEMED непосредственно перед употреблением. Комбинированный объемов должен быть равен объему разделения гель. Залить этим гелем решения в соответствующие цилиндры градиент микшера (4% в "низкий" и 15% в "высокий" цилиндр). Откройте клапан и вытеснить пузырьки воздуха внутри канала, соединяющего два водохранилища гель, нажав на левую цилиндр с большим пальцем. Включите магнитной мешалкой, снимите зажим, и включить насос peristalitic по 5 мл в минуту. Разрешить гель медленно потока между стеклянными пластинами. Убедитесь, что игла всегда выше жидкости. Разрешить все жидкости ввести гель аппарата, а затем наложение осторожно изопропанола. Разрешить гель для полимеризации, по крайней мере 30 мин при комнатной температуре. Чистая проливным аппарата сразу с дН 2 O (не используйте моющие средства). Удалить изопропанол, промыть дН 2 O, и удалить дН 2 O с ватмане. Подготовка 3,2% концентрирующий гель (рецепт 7), добавив, APS и TEMED непосредственно перед употреблением. Налейте концентрирующий гель на вершине разделения гель и ввести гребень между стеклянными пластинами, избегая пузырей. После укладки гель полимеризуется, прохладный гель до 4 ° C. Непосредственно перед загрузкой образца, удалите гребень медленно, потянув ее под углом к ​​плоскости геля. Это позволяет воздуху поступать в карманы быстро, что улучшает качество скважин. 3. Разделение диализу лизат ячейки БН-СТРАНИЦА Нагрузка от 1 до 40 мкл лизата диализу и от 10 до 20 мкл Маркер Mix (рецепт 10) в сухих скважин при температуре 4 ° C. Наложение образцов в каждую лунку с холодным катодом буфера (рецепт 8). Заполните внутренней камеры с холодной Cathode буфера и наружный / нижняя палата с холодной буфера Анодные (рецепт 9). Применить от 100 В до 150 В или minigel в значительной гель, пока образцы ввели разделение геля. Выполнить гель при температуре 4 ° C. Повышение напряжения до 180 В (minigel) или 400 В (большие гель) и продлится до красителя перед достигает конца геля. Запустить занимает от 3 до 4 часов для мини-и от 18 до 24 часов для большого геля. 4. Второе измерение SDS-PAGE Подготовка стандартных 10% SDS-гель (рецепты 12-15) с одной большой полосы для первого измерения БН-PAGE переулок, одну очередную полосу движения для маркер молекулярного веса, и одну очередную полосу движения для Аликвоту диализовали лизат, которая смешивают с SDS образца буфера (рецепт 11) и кипятят в течение 5 мин при 95 ° C. Используйте прокладки, толщина которых была увеличена на два слоя скотча для упрощения загрузки БН-ПААГ геля на SDS гель. Удалить БН-PAGE гель в плиты из аппарата электрофореза и аккуратно приподнимите одну пластину. Удалить концентрирующий гель и вырезать полосу БН-PAGE гель, содержащий белки, представляющих интерес. Место БН-ПААГ геля в 2 раза SDS буфера выборки и инкубировать в течение 10 мин при комнатной температуре. Отварите БН-PAGE геля кратко (не более 20 сек) в микроволновой печи. Инкубируйте БН-PAGE геля в горячей Пример SDS буфера в течение еще 15 минут при комнатной температуре. Нагрузка БН-ПААГ геля в больших свыше укладки гель SDS-PAGE гель избегая пузырьков воздуха, и наложения ломтик буфером Пример SDS. Нагрузка маркер и лизат контроля. Выполните электрофореза в соответствии со стандартными протоколами. 5. Обнаружение подразделения ПДК иммуноблоттинга Для передачи, подготовить шесть Ватман бумаг и мембраны PVDF установки на размер SDS-гель. Инкубируйте мембраны PVDF в 100% метаноле в течение 30 с и понежиться Ватман статей в буфер передачи (рецепт 16). Поместите три ватмана бумаг, мембраны PVDF, SDS-гель (снять концентрирующий гель), и снова три ватмана статей в сэндвич-подобные структуры в полусухого переноса. Применяют 20 В в течение 25 мин. Обнаружение белков в соответствии со стандартными протоколами иммуноблоттинга. 6. Представитель Результаты Мы представляем анализ эукариотической 19S, 20S, 26S и протеасом в качестве примера для характеристики ПДК в 2D-BN / SDS-PAGE (рис. 1А). НЕК293 лизировали с буфером, содержащим 0,1% Тритон Х-100, как моющее средство сорвать мембран и растворить комплексов мембранных белков. Эти лизаты диализу против БН-диализа буфера для удаления солей и малых метаболитов. Затем, ПДК были разделены 4-15% градиент БН-PAGE затем второе измерение SDS-PAGE. Белки были визуализированы с помощью метода иммуноблоттинга с антителами против субъединиц β2 и Mcp21 из 20S протеасомы. Рисунок 1. Двумерных BN-PAGE/SDS-PAGE подход с использованием сотовой лизатов. () Принципиальная схема 2D подход BN-PAGE/SDS-PAGE из ячеистого лизатов. (В) Схема схема 2D BN-PAGE/SDS-PAGE. Белки и ПДК разделены под родной условий БН-PAGE в первом измерении. Для второго измерения, белков и / или ПДК денатурированного с помощью ДСН в геле полоса после отделения БН-PAGE и затем подвергают SDS-PAGE. Мономерные белки будут мигрировать в гиперболической диагональные связи с градиентом геля в первом и линейного геля во втором измерении. Компоненты одного конкретного MPC будет найден ниже диагонали, расположенные на вертикальной линии. Было показано, что сочетание первого измерения БН-и второе измерение SDS-PAGE, мономерные белки мигрировать в гиперболической диагональные связи с градиентом геля в первом и линейного геля во втором измерении ((Камачо Карвахаль, Wollscheid и др. др. 2004);. рис. 1b). Компоненты ПДК расположены ниже этой диагонали. Белки, которые представляют подразделения одного и того же MPC можно найти в одной вертикальной линии во втором измерении, в то время нескольких местах одного и того же белка в горизонтальной линии указывает на наличие белка в нескольких различных ПДК. Рисунок 2 показывает, что в нашем эксперименте иммуноблоттинга против β2 и Mcp21 показал наличие специфических белковых комплексов, содержащих эти протеасомной субъединицы. Оба белка были обнаружены в виде отдельных пятен, расположенных в горизонтальной линией, указывая, что β2 и Mcp21 представляют компоненты нескольких различных ПДК. Эти ПДК можно четко определить как 26S протеасом (20S 19S плюс крышка), 20S протеасомы вместе с регуляторной субъединицы PA28 и 20S протеасом только на основании их размера и состава. Взятые вместе, эти resuLTS продемонстрировать, что эндогенные ПДК могут быть идентифицированы и характеризуется двумерным BN-PAGE/SDS-PAGE подход с использованием сотовой лизат. Этот метод применим для определения размера, состава и относительного содержания ПДК. Рисунок 2. Обнаружение различных форм эукариот протеасом путем иммуноблоттинга после двумерного BN-PAGE/SDS-PAGE. Для выявления и анализа эукариот протеасом, HEK293 лизировали с 0,1% Тритон Х-100. Сотовая лизаты диализуют и затем подвергают БН-PAGE (4-15%), чтобы отделить ПДК. Впоследствии, второе измерение SDS-PAGE (10%) был запущен на размер разделения отдельных компонентов. Иммуноблоттинг была выполнена со специфическими антителами признании Mcp21 и β2 субъединицы комплекса ядро ​​20С, а регуляторная субъединица PA28. I. Таблица специфических реагентов (в алфавитном порядке): Реагент Компания Комментарии 6-aminohexanoic кислоты (Ε-аминокапроновая кислота) Sigma-Aldrich, Тауфкирхен, Германия Это химическое вещество раздражающего и должны быть обработаны с перчатками. Акриламид-bisacrylamide решение (40%), Mix 32:1 AppliChem, Дармштадт, Германия Это решение является нейротоксическое и должны быть обработаны с перчатками. Бис-трис Рот, Карлсруэ, Герма-Нью-Йорк Бридж 96 Sigma-Aldrich, Тауфкирхен, Германия Кумасси синий G250 Служанка, Гейдельберг, Германия многих Не заменять другими видами Кумасси красителей, таких как Кумасси синий R250 или коллоидной Ку-Масси блюз. Дигитонин Sigma-Aldrich, Тауфкирхен, Германия Дигитонин является токсичным. Перчатки должны быть надеты при обработке буферов или образцов, содержащих это моющим средством. Dodecylmaltoside AppliChem, Дармштадт, Германия Тритон Х-100 Рот, Карлсруэ, Герма-Нью-Йорк Тритон Х-100 является токсичным. Перчатки должны быть надеты при обработке буферов или образцов, содержащих это моющее средство. II. Таблица конкретных материалов и оборудования: Оборудование Компания Диализ мембраны (молекулярный вес отсечки 10 до 50 кДа) Рот, Карлсруэ, Германия Система Гель-электрофорез Например, из Bio-Rad, Мюнхен, Германия Градиент смесителя Самодельные или коммерчески доступны от Bio-Rad, Мюнхен, Германия Перистальтический насос Amersham Pharmacia Biotech, Фрайбург, Германия Поливинилиденфторид дифторида (PVDF) мембраны Immobilon-P, Millipore, Эшборн, Германия Полусухой передачи оборудования Например, из Bio-Rad, Мюнхен, Германия Силиконовая трубка (от 3 до 5 мм в диаметре, 1 м длины) NeoLab, Гейдельберг, Германия III. Таблица рецептов: Нет. Буферы и решения Содержание Комментарии 1 Фосфатно-солевом буфере (PBS) Na 2 HPO 4 8,1 mMKH 2 PO 4 1,5 мМ NaCl 138 мм 2,7 мМ KCl Решение должно быть рН 7,4, если подготовлено должным образом. 2 БН-лизирующего буфера База буфер Бис-20 мМ трис ε-аминокапроновой кислоты 500 мМ NaCl 20 мМ ЭДТА, рН 8,0, 2 мМ Глицерин 10% Отрегулируйте рН до 7,0 с помощью соляной кислоты. Хранить при температуре 4 ° С. Моющее средство Дигитонин 0,5 до 1,0% или Brij 96 от 0,1 до 0,5% или Тритон Х-100 от 0,1 до 0,5% или Dodecylmaltoside 0,1 до 0,5% Протеаз и ингибиторов фосфатазы Апротинин 10 мкг / мл Leupeptin 10 мкг / мл PMSF 1 мМ Фторид натрия 0,5 мМ Натрий ортованадата 0,5 мМ Соответствующих моющих средств должны быть определены эмпирически и должна быть такой же, что и в других рецептов буфера для лизиса. Дигитонин должны быть добавлены непосредственно перед употреблением из 2% маточного раствора в дН 2 O (магазин в 5-мл аликвоты при -20 ° С). Протеазы и phophatase ингибируют-ORS следует добавить непосредственно перед употреблением. При добавлении натрия orthova-nadate, буфер станет желтоватого цвета. 3 БН-диализа буфера База буфер Бис-20 мМ трис ε-аминокапроновой кислоты 500 мМ NaCl 20 мМ ЭДТА, рН 8,0, 2 мМ Глицерин 10% Отрегулируйте рН до 7,0 с помощью соляной кислоты. Хранить при температуре 4 ° С. Моющее средство Дигитонин 0,3 до 0,5% или Тритон Х-100 0,1% или Brij 96 0,1% или Dodecylmaltoside 0,1% Протеаз и ингибиторов фосфатазы PMSF 1 мМ Натрий ортованадата 0,5 мМ Соответствующих моющих средств должны быть определены эмпирически и должна быть такой же, что и в других буферах лизис, но в указанных ниже концентрациях. Моющие средства должны быть добавлены, чтобы предотвратить агрегирование на шаг укладки гель-электрофореза. Протеазы и phophatase ингибируют-ORS следует добавить непосредственно перед употреблением. 4 3x БН-гель буфера Бис-150 мМ трис ε-аминокапроновой кислоты 200 мМ Отрегулируйте рН до 7,0 с помощью соляной кислоты. Хранить при температуре 4 ° С. 5 4% Разделение Гель 3x БН-гель буфера (рецепт 4) 5,00 мл Акриламид / Bisacrylamide 1,50 мл дН 2 O 8,50 мл APS, 10% в дН 2 O 54 мкл TEMED 5,4 мкл Добавить APS и TEMED immedia-tely перед заливкой геля, так как эти реагенты способствующих полимеризации. Этот рецепт достаточно, чтобы бросить 30-мл геля. Отрегулируйте объемы количество и размер гели льется. 6 15% Разделение Гель 3x БН-гель буфера (рецепт 4) 5,00 мл Акриламид / Bisacrylamide 5,63 мл Глицерин 70% 4,38 мл APS, 10% в дН 2 O 42 мкл TEMED 4,2 мкл Добавить APS и TEMED immedia-tely перед заливкой геля, так как эти реагенты способствующих полимеризации. Этот рецепт достаточно, чтобы бросить 30-мл геля. Отрегулируйте объемы количество и размер гели льется. Концентрация акриламида bisacrylamide также может быть изменена по мере необходимости с 10 до 18%. 7 3,2% Укладка Гель 3x БН-гель буфера (рецепт 4) 3,00 мл Акриламид / Bisacrylamide 0,72 мл дН 2 O 5,28 мл APS, 10% в дН 2 O 120 мкл TEMED 12 мкл Добавить APS и TEMED immedia-tely перед заливкой геля, так как эти реагенты способствующих полимеризации. Этот рецепт достаточно, чтобы бросить 30-мл геля. Отрегулируйте объемы количество и размер гели льется. 8 Катод буфера Бис-15 мМ трис Tricine 50 мМ Кумасси синий G250 0,02% Подготовка 1 литр, как 10-кратный запас, отрегулировать рН до 7,0 с помощью соляной кислоты, и хранить при температуре 4 ° C. Развести 1:10 с дН 2 O перед использованием. Не заменять другими видами Кумасси красителей, таких как Кумасси синий R250 или коллоидной блюз Кумасси. 9 Анодный буфер Бис-50 мМ трис Подготовка 1 литр, как 10-кратный запас, отрегулировать рН до 7,0 с помощью соляной кислоты, и хранить при температуре 4 ° C. Развести 1:10 с дН 2 O перед использованием. 10 Маркер Mix Альдолазы (158 кДа) 10 мг / мл Каталазы (232 кДа) 10 мг / мл Ферритин (440 и 880 кДа) 10 мг / мл Тиреоглобулина (670 кДа) 10 мг / мл BSA (66 и 132 кДа) 10 мг / мл Бис-20 мМ трис NaCl 20 мМ Глицерин 10% Отрегулируйте рН до 7,0 с помощью соляной кислоты. Хранить при температуре 4 ° С. Молекулярные маркеры вес также коммерчески доступны из нескольких источников, в том числе Инвитро поколения или Pharmacia. 11 SDS Пример буфера Трис 12,5 мм SDS 4% Глицерин 20% Бромфенола синий 0,02% Отрегулируйте рН до 6,8. Чтобы уменьшить дисульфидных связей, добавить 9 мл β-меркаптоэтанола. SDS в виде порошка и β-Мер-captoethanol являются токсичными. Поэтому используйте перчатки и работать под капотом. 12 4x нижнего буфера 1,5 М Трис SDS 0,4% Отрегулируйте рН до 8,8. SDS в виде порошка является токсичным. Поэтому используйте перчатки и работать под капотом. 13 4-кратный верхний буфер Трис 0,5 M SDS 0,4% Отрегулируйте рН до 6,8. SDS в виде порошка является токсичным. Поэтому используйте перчатки и работать под капотом. 14 10% Разделение Гель Акриламид (30%) 2,0 мл 4x ниже 1,5 мл буфера дН 2 O 2,454 мл APS, 10% в дН 2 O 40 мкл TEMED 6 мкл Добавить APS и TEMED immedia-tely перед заливкой геля, так как эти реагенты способствующих полимеризации. Этот рецепт достаточно, чтобы бросить 30-мл геля. Отрегулируйте объемы количество и размер гели льется. 15 4,8% Укладка Гель Acylamide (30%) 320 мкл 4-кратный верхний буфером 500 мкл дН 2 O 1,16 мл APS, 10% в дН 2 O 20 мкл TEMED 2 мкл Добавить APS и TEMED immedia-tely перед заливкой геля, так как эти реагенты способствующих полимеризации. Этот рецепт достаточно, чтобы бросить 30-мл геля. Отрегулируйте объемы количество и размер гели льется. 16 Полусухое передача буфера Трис 48 мМ Глицин 39 мм Метанол 20% SDS 0,1% Регулировка громкости до 1 литра дН 2 O. Хранить при комнатной температуре. SDS в виде порошка и метанола являются токсичными. Поэтому используйте перчатки и работать под капотом.