Electron Spin Resonantie Micro-imaging van Live Species voor zuurstof in kaart brengen

1. Overzicht van de ESR Micro-imaging Eerst geven we een korte uitleg van de ESR, ESR microscopie, en de verschillende onderdelen van ons systeem, en dan zullen we de werkelijke imaging experimenten. Elektron spin resonantie is een spectroscopische techniek waarbij elektromagnetische straling op een bepaalde frequentie wordt geabsorbeerd door moleculen met ongepaarde elektron spins, geplaatst onder een extern statisch magnetisch veld (figuur 1). ESR is werkzaam in grote gebieden van de wetenschap, zoals scheikunde, biologie, natuurkunde en materiaalkunde, voor de detectie en identificatie van vrije radicalen en paramagnetische centra. Het is een krachtige methode voor het bestuderen van het milieu van paramagnetische moleculen in levende soorten en geeft informatie over de zuurgraad (pH), viscositeit, zuurstof en reactive oxygen species concentraties van 3. Voor heterogene monsters, kan ESR spectrale informatie worden verkregen in een ruimtelijk opgelost manier (dat wil zeggen, door het verkrijgen van een afbeelding), door het gebruik van het magnetisch veld gradiënten 4. Dit is zeer vergelijkbaar met de meer gebruikelijke methode van magnetic resonance imaging (MRI) die vooral merkt proton spins. Tot nu toe werden dergelijke ESR beeldvormende technieken toegepast voor levende specimens met een relatief grote omvang van een paar centimeter omhoog en in mm-schaal resolutie. (Bijvoorbeeld: zie figuur 2, overgenomen uit referentie 5.) Een relatief recente ontwikkeling in de ESR beeldvorming is de uitbreiding van de mogelijkheden uit te kijken naar kleine dieren in millimeter-schaal resolutie van de metingen van millimeter-en sub-millimeter-size monsters met een micron-schaal resolutie. Dit veld staat bekend als ESR microscopie, die vandaag de dag kunnen 3D-beelden te leveren ESR met een resolutie naderen een micron 2 (zie representatieve voorbeelden in figuur 3). Een ESR microscoop is in wezen vergelijkbaar met een conventionele ESR spectrometer. Het is een magneet voor het genereren van het statische veld, een magnetron voor spin-excitatie en signaal-detectie, een sonde voor het houden van het monster, en een geautomatiseerde console om de overname proces-en data handling controle. Andere componenten die uniek de ESR beeldvorming in het algemeen en ook in de bestaande ESR microkopie zijn magnetisch veld gradiënt bronnen, die deel uitmaken van het elektronische systeem, en gradiëntspoelen die zich in de beeldvorming sonde. Meer details over onze specifieke systeem zijn weergegeven in het protocol film en beschreven in referentie 2. 2. ESR Micro-imaging Monstervoorbereiding Deze fase beschrijft de methode voor monstervoorbereiding voor de ESR micro-imaging experiment. Aan het eind van deze fase cellen zijn geplaatst op de bodem van een speciaal bereide glas ESR microscopie monsterhouder, samen met een trityl radicale 6 bufferoplossing. Dit protocol beschrijft de meting van cyanobacteriën cellen en daarmee, voor andere soorten cellen, de juiste aanpassingen kunnen nodig zijn bij de monstervoorbereiding podium. Eerst worden een paar vierkanten van absorberend papier met een afmeting van ~ 400 400 micrometer genomen en ingebracht in een eppendorfbuisje, die vervolgens wordt gevuld met 1,2 ml van de cyanobacteriën suspensie (met een concentratie van 40 mg / ml). De suspensie wordt gecentrifugeerd gedurende 2 minuten bij 6000 rpm in een microcentrifuge. Na deze, is het supernatant buffer volledig verwijderd, behalve voor ~ 50 uL, die worden overgelaten aan cyanobacteriën uitdroging te voorkomen. Als gevolg van dit proces, is het absorberend papier nu verzadigd door de cyanobacteriën cellen. Met behulp van fijne pincet, zijn een paar vezels uit de krant en op de bodem van een cup-achtige speciaal geprepareerde glas monsterhouder 7. Naar aanleiding van dat een 3 mM van trityl in BG-11-oplossing 8, 9 (zie Schema 1) wordt toegevoegd aan de monsterhouder met behulp van een fijne spuit. De houder wordt vervolgens afgedicht met behulp van UV-lijm, waardoor een kleine luchtuitlaat te openen. Voorraad 4 Voorraad 3 Voorraad 2 Voorraad 1 H 3 BO 3 2.86g/liter K 2 HPO 4: 3H 2 O 4.0g/liter MgSO 4: 7H 2 O 7.5g/liter Na 2 mg EDTA 0.1g/liter MnCl 2: 4H 2 O 1.81g/liter Ijzer ammoniumcitraat 0.6g/liter ZnSO 4: 7H 2 O 0.222g/liter Citroenzuur: 1H2O 0.6g/liter </td> CuSO 4: 5H 2 O 0.079g/liter CaCl 2: 2H 2 O 3.6g/liter COCl 2 : 6H 2 O 0.050g/liter NaMoO 4: 2H 2 O 0.391g/liter Schema 1. Voorbereiding van de BG-11 medium. 3. ESR Micro-imaging experimenten Om te beginnen de beeldvorming experiment, zet de ESR micro-imaging-systeem en breng het monster in de resonator, dat gaat in de imaging-sonde. Nu, met behulp van de computer te bedienen software, zet het systeem op "Tune" mode en vind de resonantie microgolf frequentie van de sonde, die zal worden gebruikt voor de ESR metingen. Naar aanleiding van dat, het statisch magnetisch veld ingesteld op de waarde die de toegepaste microgolf frequentie wedstrijden, de timing parameters voor de pulssequentie en observeer de ESR signaal om ervoor te zorgen dat het systeem goed functioneert en het monster is goed voorbereid. Stel vervolgens de imaging parameters, zoals het aantal pixels, de sterkte van de hellingen, en de lengte van het verloop pulsen om de vereiste waarden. Na de installatie, het verzamelen van drie 3D-beelden door een ESR Hahn echo imaging pulssequentie (figuur 4) met interpulse scheiding, de waarden van  500, 600 en 700 ns. Licht geprojecteerd op het monster is in-of uitgeschakeld, afhankelijk van de vereiste experimentele omstandigheden. Tijdens de overname, worden de gegevens automatisch opgeslagen. Scripties ruwe data bestanden worden vervolgens verwerkt via Matlab software script om beelden van de trityl radicale concentratie en de relaxatietijd T 2 kaart, die wordt vertaald naar een zuurstofconcentratie afbeelding via reeds bestaande calibratie te bieden. 4. Representatieve resultaten De uitkomsten van het experiment zijn verschillende drie-dimensionale ESR micro-beelden die op verschillende τ waarden. Typische ruwe data beelden worden gegeven in figuur 5. De top drie beelden, gemeten onder donkere omstandigheden, zijn zeer vergelijkbaar, behalve voor vermindering van het signaal intensiteit. Aan de andere kant, het beeld patroon verandert onder lichte bestraling te wijten aan de verschillende relaxatietijden in verschillende delen van het monster. Deze gegevens kunnen worden verwerkt tot een een amplitude beeld te verkrijgen, zoals weergegeven in figuur 6, maar ook beelden van de relaxatietijd, T 2 (figuur 7). De T 2 beelden worden omgezet in zuurstof waarden via een reeds bestaande calibratie curve die de zuurstof concentratie naar de relaxatietijd via de vergelijking links: Hier, T 2 0 is de spin-spin relaxatietijd van de sonde onder zuurstofloze omstandigheden (afhankelijk van de concentratie van de sonde, C, en de diffusiecoëfficiënt, D), en k een evenredigheidsconstante. In de meeste gevallen, is de diffusie coëfficiënt niet veel afwijken van levende monsters (hoewel, indien nodig, het kan in principe ook direct worden geëvalueerd door ESR 6, 10), en de spin concentratie is verkregen tijdens het beeldvormingsproces. Daarom kan deze relatie worden gebruikt om rechtstreeks te meten zuurstofconcentratie. Terug te gaan naar figuur 6, blijkt uit de amplitude beeld dat de cyanobacteriën cellen bevonden zich vooral op de rechterkant van de monsterhouder. Bovendien, op basis van figuur 7, is het duidelijk dat licht de productie van O 2 initieert en leidt tot een aanzienlijke toename van O van de oplossing 2-concentratie, vooral in de voxels de buurt van de cyanobacteriën. Figuur 1: Energie niveaus in elektron spin resonantie. Figuur 2: Typische zuurstofconcentratie beeld van een tumor dragende muizen. De afbeelding aan de linkerkant toont de anatomische informatie, op basis van een MRI-beeld. Een stabiele vrije organische radicaal werd geïnjecteerd om de muis en de ESR kenmerken bieden de zuurstofconcentratie in de omgeving (rechts). ESR-based resultaten zijn bovenop MRI anatomische beeld. Gezichtsveld is 32 mm. Figuur 3: Twee voorbeelden van hoge resolutie micro-schaal ESR beelden van photolithographically gegenereerde monster met N @ C 60 poeder (links) en LiPc paramagnetische kristallen (rechts) Figuur 4: Typische Hahn beeldvorming pulssequentie met de magnetron (MW) en de gradiënt, G x, y G en G z pulsen. Figuur 5: Typische raw-data ESR micro-beelden: a, b, en c de ruwe gegevens van de cyanobacterie monster zonder licht gemeten verlichtingssterkte voor τ = 500600700 ns, respectievelijk. Items d, e, en zijn hetzelfde als a, b en c maar met licht verlichting. Intensiteit is uitgezet in willekeurige schaal (maar is consistent binnen elke set van drie donkere of lichte ruwe data beelden) Figuur 6: Amplitude afbeelding die overeenkomt met de radicale concentratie in de oplossing (willekeurige schaal). Figuur 7: T 2 foto's en de bijbehorende [O 2] waarden onder donker (links) en licht (rechts) omstandigheden.