더블 형광 현장에서 하이브 리다이 제이션
Summary
이 프로토콜은 아닌 방사성을 포함<em> 원위치</em척추 두뇌의 얇은 부분에서, 단일 셀 해상도로 두 사본 종의 동시 확인 가능> 하이브 리다이 제이션 절차.
Abstract
여기서 우리는 두 형광의 수정된 버전을 설명<em> 현장에서</em> 하이브 리다이 제이션 (dFISH) 메소드 신선한 냉동 뇌 부분에 대한 관심의 두 mRNAs 검출에 최적화된. 우리 그룹은 성공적으로 유전자 공동 규제를 공부하기 위해이 방법을 사용하고 있습니다. 더 구체적으로, 우리는 단세포 해상도의 해부 조직 neurochemical 특성, 및 중앙 감각 회로의 감각적 경험의 영향을 탐험이 dFISH 방법을 사용했습니다. 이 프로토콜은 쥐, 쥐 및 노래하는 새는에서 뇌 조직에서 검증된되었지만 쉽게 다른 척추 종 적용할뿐만 아니라 이외의 신경 조직의 배열로 될 예정입니다. 이 영화에서 우리는이 절차의 주요 단계에 대한 자세한 데모를 제공합니다.
Protocol
이 프로토콜은 이전에 뇌 조직 1-7에 하나 또는 두 개의 사본 수종을 감지하는 우리와 다른 사람에 의해 개발된 표준 방사선이 아닌 방사선 원위치 하이브리드화 방법에 따라 개발 및 정제되었다. 아래에서 설명하는 프로토콜은 최종 사용자가 선택한 절차 중단의 수에 따라 2 ~ 3 일 총 길이있다. 아래의 자세한 모든 단계가 riboprobe의 하이브리드화 단계 및 사후 하이브 리다이 제이션…
Discussion
우리는 척추 두뇌가 neurochemically 및 기능 구성 방법 연구, 어떻게 behaviorally – 관련 감각 자극에 미치는 영향 성인 뇌 8-10에서 뉴런의 게놈 기기 확인하기 위해이 프로토콜을 사용하고 있습니다. 우리는 성공적으로 마우스, 쥐 그리고 노래하는 새는에서 뇌 조직에서이 방법을 사용하지만,이 프로토콜은 척추 동물의 배열, 그리고 아마도이 아닌 신경 조직에서 얻은 뇌 부분에 쉽게 적용할 수?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
NIH / NIDCD 및 RP에 슈미트 재단의 보조금에 의해 지원 작동합니다.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| DEPC | VWR | IC15090225 | toxic substance | |
| PCR purification kit | QIAgen | 28104 | ||
| Formaldehyde | VWR | BDH0506-4LP | toxic substance | |
| T3 RNA polymerase | Roche | 11031163001 | ||
| T7 RNA polymerase | Roche | 10881767001 | ||
| Tris-HCl (1 M, pH 7.5) | VWR | IC816124 | ||
| MgCl2 (1 M) | Sigma | 449172 | ||
| Spermidine (1 M) | Sigma | S0266 | ||
| DIG RNA labeling mix | Roche | NC9380805 | ||
| Biotin RNA labeling mix | Roche | NC9440104 | ||
| RNasin | Promega | N2111 | ||
| BSA | Sigma | 05491 | ||
| DTT | Sigma | D5545 | ||
| Sephadex G50 | VWR | 95016-772 | ||
| EDTA | VWR | 101384-758 | ||
| SDS | Sigma | L4390 | ||
| Transfer (t)RNA | Invitrogen | 15401011 | ||
| 10X MOPS | VWR | 14221-398 | toxic substance | |
| Paraformaldehyde | VWR | AAAL04737-36 | toxic substance | |
| Sodium phosphate monobasic | Sigma | S3139 | ||
| Sodium phosphate dibasic | Sigma | S3264 | ||
| NaOH | VWR | SX0600-1 | ||
| Triethanolamine | VWR | IC15216391 | ||
| Acetic anhydride | VWR | MK242002 | toxic substance | |
| SSPE | VWR | 82021-488 | ||
| Formamide | VWR | JT4028-1 | toxic substance | |
| Poly A | Invitrogen | POLYA.GF | ||
| Mineral oil | VWR | IC15169491 | ||
| Chloroform | VWR | BDH1109 | organic solvent | |
| Deionized formamide | Sigma | F9037 | toxic substance | |
| Hydrogen peroxide | VWR | VW36901 | toxic substance | |
| Tween 20 | Sigma | P1379 | ||
| Triton X-100 | J. T. Baker | X198-05 | ||
| Anti-DIG HRP | Roche | 11093274910 | ||
| Anti-biotin peroxidase | Vector | SP3010 | ||
| TSA Alexa Fluor 594 | Invitrogen | T20935 | ||
| TSA Alexa Fluor 488 | Invitrogen | T20932 | ||
| Hoechst | VWR | 200025-538 | ||
| Vectashield | Vector | H-1000 | ||
| embedding mold | VWR | 15160-157 | ||
| cryostat | Leica | CM 1850 | ||
| Superfrost plus slide | VWR | 89033-052 |
Solutions
- Column washing buffer: 10 mM Tris-HCl, 0.15 M NaCl, 0.05 mM EDTA, 50 μg/μl tRNA, 0.1% SDS in 50 ml DEPC-treated water.
- Column blocking buffer: 10 mM Tris-HCl, 50 mM NaCl, 0.1 mM EDTA in 50 ml DEPC-treated water.
- TNT buffer: 60 ml of 1 M Tris-HCl, 18 ml of 5 M NaCl and 1.8 ml of Triton X-100 in 600 ml of DEPC-treated water.
- TNB buffer: 100 mM Tris-HCl, 8.3 μg/μl BSA, 0.15 M NaCl and 3% Triton X-100 in DEPC-treated water.
- TE buffer: 10 mM Tris-HCl, pH 7.5 plus 1 mM EDTA, pH 7.5.
- Acetylation solution: 2.7 ml of triethanolamine plus 0.5 ml of acetic anhydride in 200 ml of DEPC-treated water.
- Hybridization solution: 50% formamide, 2X SSPE, 2 μg/μl tRNA, 1 μg/μl BSA and 1 μg/μl poly A in DEPC-treated water. It needs 16 l per section.
References
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Cite This Article
Jeong, J. K., Chen, Z., Tremere, L. A., Pinaud, R. Double Fluorescence in situ Hybridization in Fresh Brain Sections. J. Vis. Exp. (42), e2102, doi:10.3791/2102 (2010).