Langendorff-mode isolerade hjärta genomblödning, i samband med<sup> 31</sup> P NMR-spektroskopi, kombinerar inom biokemi och fysiologi i ett experiment. Protokollet möjliggör dynamisk mätning med hög energi fosfathalt och omsättning i hjärtat, medan samtidigt övervaka fysiologiska funktion. När de utförs på rätt sätt, är detta en värdefull teknik vid bedömningen av hjärt energetik.
Genmanipulerad musmodeller har blivit kraftfullt forskningsverktyg för att fastställa orsakssambanden mellan molekylära förändringar och modeller av hjärt-kärlsjukdom. Även molekylärbiologi är nödvändigt att fastställa de centrala förändringarna i signalväg, är det inte ett surrogat för funktionell betydelse. Medan fysiologi kan ge svar på frågan om funktionen, som kombinerar fysiologi med biokemiska utvärdering av metaboliter i den intakta, bultande hjärta ger en komplett bild av hjärtfunktion och energin. Under flera år har vårt laboratorium använde isolerade hjärta perfusion i kombination med kärnmagnetisk resonans (NMR) för att utföra denna uppgift. Vänsterkammarfunktion bedöms av Langendorff-mode isolerade hjärta perfusion medan hjärt energin mäts genom att utföra<sup> 31</sup> P resonansspektroskopi av perfusion hjärtan. Med dessa tekniker kan index för hjärtfunktion i kombination med nivåer av phosphocreatine och ATP mätas samtidigt slående hjärtan. Dessutom kan dessa parametrar övervakas under fysiologiska och patologiska faktorer har inletts. Till exempel kan ischemi / reperfusion eller hög arbetsbelastning protokoll utmaningen antas. Användningen av aorta ränder eller andra modeller av hjärt-patologi är apt också. Oberoende av varianter inom protokollet, kan de funktionella och energiska betydelsen av molekylära förändringar av transgena musmodeller vara utförligt beskrivna, vilket leder till nya insikter tillhörande enzymatiska och metaboliska vägar. Därför<sup> 31</sup> P NMR-spektroskopi i isolerade perfusion hjärtat är en värdefull forskning teknik i djurmodeller av hjärt-kärlsjukdom.
31 P NMR-spektroskopi i Langendorff-perfusion isolerade mus hjärta ger tillförlitliga och reproducerbara data. 3, 4 Det är dock viktigt att kanylering av aorta och införandet av LV ballongen görs på rätt sätt så att en stabil hjärt prestanda samtidigt inne i NMR röret. Dessutom är temperaturreglering av största vikt för att uppnå god baslinjen funktion. En viktig faktor för att erhålla god, analyserbart NMR-spektra ökar signal-brus-förhållande. Detta kan uppnås genom att säkerställa optimal "Tuning" och "mellanlägg" på provet. Som nämnts i protokollet texten, kan användningen av ett standardprov före införandet av hjärtat underlätta detta. Det är också bra att ha en tillräcklig storlek "sample". Hjärtan som väger mindre än 100 mg ger oftast lägre PCR och ATP-signaler så ökar i förvärvet tid kommer att krävas för att få bra fosfor-spektra.
Det finns flera sätt att ändra det nuvarande protokollet att samla ytterligare information om hjärtats funktion och energier. I vårt laboratorium har vi perfusion hjärtan med blandade substrat buffertar som kan omfatta förekomsten av olika kombinationer av fettsyror (i låga och höga koncentrationer), laktat, ketoner, och insulin. Med hjälp av stabila isotoper i perfusion bufferten (dvs 13 C-märkt substrat), vi har förmågan att uppskatta substrat utnyttjande av den relativa betydelsen av märkt acetyl CoA till TCA cykeln. 5-7 För denna tillämpning utför vi isotopomer analys av 13 C3 och 13 C4-glutamat med 13 C-NMR-spektroskopi. Detta kräver freeze-fastspänning hjärtat i slutet av perfusionen protokoll och utföra en extraktion av den frusna vävnad. Detta kommer att bli ytterligare ett experiment som analysen kräver användning av en annan sond med separata inställningar parametrar. Andra tillämpningar är att ersätta glukos med deoxyglucose i bufferten samtidigt övervaka tidsberoende ackumulering av 2-deoxyglucose fosfat i hjärtat med hjälp av 31 P NMR-spektroskopi. Denna metod gör det möjligt för mätning av hjärtinfarkt glukosupptaget. 7, 8 dessutom vårt laboratorium har analyserat hjärtfunktion och energin i perfusion protokoll bestående av ischemi / reperfusion och hög arbetsbelastning utmaning. 6, 8-10
Sammanfattningsvis är 31 P NMR-spektroskopi i enstaka mus hjärtan en tekniskt utmanande förfarande som kräver användning av avancerad utrustning. Däremot är de data som den ger ovärderlig för forskare som vill analysera funktion och energetiken av genmanipulerad mus modeller. För vårt laboratorium har dessa tekniker varit avgörande för vår förståelse av konsekvenserna av olika stressfaktorer på hjärtats funktion, energetiken och ämnesomsättning. 1, 11, 12
The authors have nothing to disclose.
Författarna vill tacka Lynne Spencer för hennes stöd under NMR-spektroskopi delen av experimentet. Detta arbete har finansierats med bidrag från National Institutes of Health fond R01 HL059246, R01 HL067970, R01 HL088634 (till Dr Tian) och F32 HL096284 (Dr Kolwicz).
Material Name | Type | Company | Catalogue Number |
Magnesium Sulfate | Reagent | Sigma Aldrich | M7506 |
EDTA | Reagent | Sigma Aldrich | E1644 |
Potassium chloride | Reagent | Sigma Aldrich | P4505 |
Sodium bicarbonate | Reagent | Sigma Aldrich | S6297 |
Sodium chloride | Reagent | Sigma Aldrich | S7653 |
Calcium chloride dihydrate | Reagent | Sigma Aldrich | C5080 |
D-Glucose | Reagent | Sigma Aldrich | G7528 |
Sodium Pyruvate | Reagent | Sigma Aldrich | P2256 |
Bruker Ultrashield 600WB Plus | Equipment | Bruker | |
PowerLab 4/30 | Equipment | ADInstruments | ML866/P |
LabChart 6 Pro | Equipment | ADInstruments | MLS260/6 |
Quad Bridge Amp | Equipment | ADInstruments | ML224 |
STH Pump Controller | Equipment | ADInstruments | ML175 |
Minipuls 3 Peristaltic Pump | Equipment | ADInstruments | ML172 |
Disposable BP Transducer | Equipment | ADInstruments | MLT0699 |
10mm NMR Sample Tube | Equipment | Wilmad LabGlass | 513-7PP-7 |
Polyethylene tubing PE10 | Equipment | Becton-Dickinson | 427401 |
Physiological Pressure Transducer | Equipment | ADInstruments | MLT844 |
Polyethylene tubing PE50 | Equipment | Becton-Dickinson | 427411 |
Micrometer syringe | Equipment | Gilmont Instruments | GS-1101 |
McPherson Forceps | Equipment | Miltex Inc. | 18-949 |
Castraviejo microscissors | Equipment | Roboz Surgical Instruments | RS-5650 |
Neoptix Signal Conditioner | Equipment | Neoptix, Inc. | Reflex – 1 |