Medición de la actividad calpaína en células fijadas y vivir por citometría de flujo
Summary
Este artículo detallará el protocolo para la medición de la actividad de la calpaína en células fijadas y la vida mediante citometría de flujo.
Abstract
Calpaínas son omnipresentes intracelular, sensible calcio, cisteína proteasas neutras<sup> 1</sup>. Calpaínas juegan un papel crucial en muchos procesos fisiológicos, incluida la señalización, la remodelación del citoesqueleto, la regulación de la expresión génica, la apoptosis y la progresión del ciclo celular<sup> 1</sup>. Calpaínas han sido implicados en muchas patologías como distrofias musculares, cáncer, diabetes, enfermedad de Alzheimer y la esclerosis múltiple<sup> 1</sup>. Calpaína regulación es compleja y no completamente entendido. los niveles de ARNm y proteínas se correlacionan poco con la actividad, lo que limita el uso de las técnicas de la expresión de genes o proteínas para medir la actividad de la calpaína. Esta detalles del protocolo de vídeo un ensayo de citometría de flujo desarrollado en nuestro laboratorio para medir la actividad de la calpaína en células fijadas y de vida. Este método utiliza el sustrato fluorescente BOC-LM-CMAC, que se escinde específicamente por la calpaína, para medir la actividad de calpaína.<sup> 2</sup> En este video, la actividad de la calpaína en fijo y que viven las células murinas 32Dkit leucemia, solo o como parte de una población de esplenocitos se mide utilizando un LSRII (BD Bioscience). 32Dkit células han demostrado tener actividad elevada en comparación con esplenocitos normales.
Protocol
Discussion
La actividad de la calpaína en células 32Dkit fijos y la vida se ha determinado en este protocolo de vídeo. El tratamiento de la línea de células con el inhibidor de la calpaína PD150606 dio lugar a una inhibición completa de la actividad de la calpaína en las células. Además, el tratamiento con el inhibidor de MEK1 PD98059 dado lugar a una inhibición completa de la actividad de la calpaína en las células. ERK es un importante activador de la calpaína-2 3. Estos resultados sugieren que la calpa?…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Apoyado por becas de los Institutos Canadienses de Investigación en Salud, la leucemia y el linfoma de la Sociedad de Canadá y la Fundación Linfoma de Canadá.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| PBS BOC-LM-CMAC 4% paraformaldehyde |
Invitrogen | Dissolve 4g paraformaldehyde in 100mL PBS. In fume hood, heat sample with stirring until clear. Let cool then store at 4°C |
||
| PD150606 | Invitrogen | Use freshly reconstituted PD150606 for maximal calpain inhibition. | ||
| PD98059 | Cell Signaling Technology | |||
| AlignFlow, AlignFlow plus fluorescent beads FACS tubes |
Invitrogen | |||
| LSR II | BD Bioscience | Supernatant of WEHI-3 cells is used as a source of IL-3 in these experiments. Each collection of WEHI-3 supernatant is titrated to determine the optimal concentration used for 32Dkit cell growth. |
References
- Goll, D. E., Thompson, V. F., Li, H., Wei, W., Cong, J. . The Calpain System. Physiol. Rev. 83, 731-801 (2003).
- Niapour, M., Berger, S. A. Flow Cytometric Measurement of Calpain Activity in Living Cells. Cytometry A. 71A, 475-485 (2007).
- Leloup, L., Daury, L., Mazéres, G., Cottin, P. Involvement of the ERK/MAP kinase signalling pathway in milli-calpain activation and myogenic cell migration. The International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 39, 1177-1189 (2007).
