Misurazione dell'attività Calpain nelle celle fissi e Living in citometria a flusso
Summary
Questo articolo dettaglio il protocollo per la misurazione dell'attività calpaina in cellule fisse e vivere in citometria a flusso.
Abstract
Calpains sono onnipresenti intracellulari, calcio-sensibili, la cisteina proteasi neutre<sup> 1</sup>. Calpains svolgono un ruolo cruciale in molti processi fisiologici, tra cui segnalazione, rimodellamento del citoscheletro, regolazione dell'espressione genica, l'apoptosi e la progressione del ciclo cellulare<sup> 1</sup>. Calpains sono stati coinvolti in molte patologie tra cui le distrofie muscolari, cancro, diabete, morbo di Alzheimer e la sclerosi multipla<sup> 1</sup>. Calpaina regolamento è complesso e non completamente compreso. livelli di mRNA e proteine correlate con l'attività poco, limitando l'uso di tecniche di espressione dei geni o proteine per misurare l'attività calpaina. Questo il video dettagli protocollo un test citometria a flusso sviluppato nel nostro laboratorio per la misurazione dell'attività calpaina in cellule fisse e viventi. Questo metodo utilizza il substrato fluorescente BOC-LM-CMAC, che viene scissa in particolare da calpaina, per misurare l'attività calpaina.<sup> 2</sup> In questo video, attività calpaina nelle cellule 32Dkit fisso e vive leucemia murina, da soli o come parte di una popolazione splenocyte viene misurata utilizzando un LSRII (BD Bioscience). Le cellule sono 32Dkit dimostrato di avere attività elevata rispetto a splenociti normali.
Protocol
Discussion
L'attività calpaina in cellule 32Dkit fisse e vita è stato determinato in questo protocollo video. Il trattamento della linea cellulare con l'inibitore della calpaina PD150606 portato a completa inibizione dell'attività calpaina nelle cellule. Inoltre, il trattamento con l'inibitore MEK1 PD98059 portato a completa inibizione dell'attività calpaina nelle cellule. ERK è un importante attivatore di calpaina-2 3. Questi risultati suggeriscono che l'attività calpaina-2 è predominante…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Supportato da sovvenzioni da parte del Canadian Institutes of Health Research, The Leukemia and Lymphoma Society of Canada e la Fondazione Linfoma del Canada.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| PBS BOC-LM-CMAC 4% paraformaldehyde |
Invitrogen | Dissolve 4g paraformaldehyde in 100mL PBS. In fume hood, heat sample with stirring until clear. Let cool then store at 4°C |
||
| PD150606 | Invitrogen | Use freshly reconstituted PD150606 for maximal calpain inhibition. | ||
| PD98059 | Cell Signaling Technology | |||
| AlignFlow, AlignFlow plus fluorescent beads FACS tubes |
Invitrogen | |||
| LSR II | BD Bioscience | Supernatant of WEHI-3 cells is used as a source of IL-3 in these experiments. Each collection of WEHI-3 supernatant is titrated to determine the optimal concentration used for 32Dkit cell growth. |
References
- Goll, D. E., Thompson, V. F., Li, H., Wei, W., Cong, J. . The Calpain System. Physiol. Rev. 83, 731-801 (2003).
- Niapour, M., Berger, S. A. Flow Cytometric Measurement of Calpain Activity in Living Cells. Cytometry A. 71A, 475-485 (2007).
- Leloup, L., Daury, L., Mazéres, G., Cottin, P. Involvement of the ERK/MAP kinase signalling pathway in milli-calpain activation and myogenic cell migration. The International Journal of Biochemistry and Cell Biology. 39, 1177-1189 (2007).
