भाग 1. सर्जिकल क्षेत्र तैयार Biohazardous अभिकर्मकों (उदाहरण के लिए रेट्रोवायरल वैक्टर) के साथ काम कर रहे हैं, यदि सर्जरी जैवसुरक्षा द्वितीय कैबिनेट (बीएससी) के अंदर किया जाना चाहिए. अल्ट्रासाउंड backscatter माइक्रोस्कोप (UBM) BSC के बगल में बैठना, BSC अंदर transducer के साथ करना चाहिए, और जगह में आयोजित एक विशेष रूप से डिजाइन शल्य मंच पर एक मोटर नियंत्रित समर्थन से. वीडियो में दिखाया चरण के निर्माण के लिए आवश्यक घटक लाइन पर सूचीबद्ध हैं. इस सूची में, मंच के कई कोण (अनुरोध पर उपलब्ध) से छवियों के साथ साथ, निर्माण की अनुमति चाहिए. प्लास्टिक के समर्थन के साथ एक शोषक पैड पर खोलने और laparotomy के समापन (शल्य प्रक्रिया है जो उदर गुहा में आंतरिक अंगों के लिए उपयोग की अनुमति के लिए खुला कट जाता है) आम तौर पर किया जाता है. शल्य चिकित्सा के लिए पहले के सभी आवश्यक उपकरण (जैसे रेजर, शल्य चिकित्सा कैंची, संदंश, लोड autoclip applier, आदि), और सामग्री (जैसे Pbs, sutures, चतनाशून्य करनेवाली औषधि, माउस धारक और overlying प्लेट, आदि) और निष्फल होना चाहिए में रखा शल्य चिकित्सा के क्षेत्र. चीरा खुला है समय की राशि सीमित सर्जरी के साथ सफलता की संभावना को अधिकतम के लिए महत्वपूर्ण है. सभी जानवर से निपटने के दस्ताने है कि MB 10-समाधान है, या समकक्ष के साथ कीटाणुरहित किया गया है के साथ किया जाना चाहिए. दोहराया कीटाणुशोधन के रूप में विश्वास दिलाता हूं कि बाँझ दस्ताने हैं की जरूरत किया जाना चाहिए. भाग 2. माउस संज्ञाहरण संवेदनाहारी भाग 1 (50 pentobarbital मिलीग्राम / एमएल) Nembutal 4 भागों 25 मिलीग्राम / पीबीएस में मिलीलीटर मैग्नीशियम सल्फेट निष्फल फ़िल्टर करने के लिए युक्त समाधान के साथ एक 1 सीसी सिरिंज भरें. यह एक समाधान है कि 10 मिलीग्राम / pentobarbital और 20 मिलीग्राम / एमएल मैग्नीशियम सल्फेट मिलीलीटर में परिणाम देगा. प्रत्येक व्यक्तिगत माउस भारित किया जाना चाहिए, और bodyweight के pentobarbital प्रति किलो के 90 मिलीग्राम इंजेक्शन के साथ (जैसे, एक 28 ग्राम माउस 250 μL के साथ इंजेक्शन होगा). (Intraperitoneal आईपी) एक गर्भवती माउस भ्रूण (ई) दिन 9.5 (अन्य उम्र के उपयोग के रूप में आवश्यक हो सकता है) पेट में सुई दोनों त्वचा और पेट की मांसपेशियों के मर्मज्ञ. 8-12 मिनट के लिए माउस को गैर जिम्मेदार बनने के लिए अनुमति दें. जानवर के आराम मुद्रा द्वारा पर्याप्त संज्ञाहरण की पुष्टि किया जाना चाहिए, और पूंछ और पैर की अंगुली pinches के जवाब में आंदोलन की कमी है. धीरे उंगली नाखूनों के बीच बन्द रखो बेहद संवेदनशील है, और ऐसी pinching के लिए किसी भी प्रतिक्रिया की कमी को इंगित करता है कि पशुओं को पर्याप्त anesthetized है. भी नोट जानवरों है कि पूरी तरह से पूंछ और पैर की अंगुली pinches अनुत्तरदायी कर रहे हैं कुछ समय प्रारंभिक शल्य चीरा के जवाब में थोड़ा चिकोटी सकता है. हालांकि, यह एक reflexive प्रतिक्रिया करता है और अपर्याप्त संज्ञाहरण का संकेत नहीं है. पेट्रोलियम आधारित नेत्र बाम माउस की आँखों के लिए लागू किया जाना चाहिए सर्जरी के दौरान सुखाने से बचने के. शल्य चिकित्सा क्षेत्र और अल्ट्रासाउंड मशीन के ऊपर सेट जबकि के लिए माउस anesthetized बनने के लिए इंतज़ार कर रही है. चूंकि retrovirus या lentivirus के उपयोग की आवश्यकता है BSL2 रोकथाम के रूप में वायरल इंजेक्शन ऊपर कहा गया है एक जैवसुरक्षा द्वितीय मंत्रिमंडल में प्रदर्शन किया जाना चाहिए. इसके अलावा, सभी समाधान और प्रयोज्य सामग्री है कि वायरस के संपर्क में आता है एक 10% ब्लीच समाधान के साथ decontaminated होना चाहिए. सर्जिकल उपकरण और अल्ट्रासाउंड उपकरण जैसे MB-10 (स्टरलाइज़ समाधान के साथ इलाज किया जाना चाहिए http://www.quiplabs.com/mb10.htm ), या एक सवाल में सुविधा के द्वारा प्रयोग किया जाता बराबर. भाग 3. भ्रूण के एक्सपोजर यदि संभव हो तो (दिया पशु सुविधा और उपलब्ध अंतरिक्ष की कमी पर निर्भर करता है) यह करने के लिए शल्य चिकित्सा क्षेत्र से एक अलग स्थान में शल्य चिकित्सा की तैयारी क्षेत्र है पसंद है. यह पशुओं के बीच पार संदूषण के लिए संभावना कम कर देंगे. सर्जरी को आरंभ करने के लिए, अपनी पीठ पर एक बाँझ शोषक सतह पर जानवर और जगह पेट क्षेत्र के 70% इथेनॉल के साथ अच्छी तरह से धो लो. अधिक व्यापक presurgical उपचार (Betadine के उदाहरण के लिए, लगातार राउंड और 70% इथेनॉल washes) नियोजित किया जा सकता है, लेकिन हमारे अनुभव में इस कृंतक अस्तित्व सर्जरी के इस प्रकार के लिए आवश्यक नहीं है. एक डबल बढ़त रेजर का उपयोग, पेट से लगभग 1 इंच चौड़ी और 1.5 इंच लंबा के एक क्षेत्र में बाल दाढ़ी. रेजर के साथ लगभग एक 45 ° कोण पर कम जल्दी गतियों का प्रयोग करें. यह महत्वपूर्ण है कि शल्य चिकित्सा के क्षेत्र उपयुक्त इलाज किया जा है, लेकिन अत्यधिक गीला करने के लिए अधीन नहीं है, के रूप में इस जानवर के अनावश्यक द्रुतशीतन में परिणाम कर सकते हैं, और संभवतः भी हाइपोथर्मिया. ठीक शल्य कैंची का प्रयोग पहली त्वचा के माध्यम से एक 1 "अनुदैर्ध्य चीरा बनाने के लिए, और फिर जानवर (संयोजी ऊतक के माध्यम से काटने मांसपेशियों के लिए त्वचा पकड़े दूसरा चीरा के साथ मदद करेगा) के पेट की मांसपेशियों के माध्यम से नोट कि प्रक्रिया देखभाल भर चाहिए विश्वास दिलाता हूं कि शल्य चिकित्सा उपकरणों बाँझ रहते हैं, और निस्संक्रामक के साथ इलाज के रूप में की जरूरत प्रदर्शन किया जाना चाहिए (यानी अगर उपकरण युक्तियाँ गैर – Ste के साथ संपर्क में आते लियासामग्री चिढ़ाना). का प्रयोग संदंश ध्यान गर्भाशय सींग आकर्षित है, और प्रत्येक पक्ष पर भ्रूण की संख्या रिकॉर्ड है. जबकि दो आसन्न भ्रूण उजागर (चयन जिनमें से दो प्रत्येक पक्ष पर विन्यास पर निर्भर करेगा), गर्भाशय सींग की सबसे जगह वापस छोड़ने जानवर में. इस संदर्भ में, दो भ्रूण को एक निश्चित समय पर उजागर किया जाएगा और पीबीएस में नहाया है, जबकि माँ उसकी पीठ पर रहता है. अपनी पीठ पर plexiglass धारक में पशु प्लेस जहां यह सर्जरी (Figure1A) के दौरान किया जाएगा *. अगला, ऊतक संस्कृति पकवान 10cm ** (जो पहले MB-10 के साथ कीटाणुरहित किया जाना चाहिए का उपयोग करने के लिए) माँ से अधिक हरी silastic (एल RTV सिलिकॉन रबर आधार का उपयोग किया, झिल्ली के माध्यम से थोड़ा रखा संदंश की एक जोड़ी के साथ नीचे कम इलाज एजेंट, डॉव Corning उत्पाद संख्या 3142761 और 2156946, क्रमशः). जैसा कि आप जानवर पर थाली नीचे कम करने के लिए, संदंश का उपयोग करने के लिए दो इंजेक्शन जा भ्रूण के बीच गर्भाशय ऊतक पकड़ है, और धीरे से उन्हें झिल्ली के माध्यम से खींच. उसी समय, थाली धारक पर पूरी तरह से नीचे उतारा है, और थम्बपिन में धकेल रहे हैं के लिए यह जगह में पकड़ है. पूर्व गर्म (37 डिग्री सेल्सियस) पीबीएस तो पकवान पूरी तरह से भ्रूण को कवर करने के लिए जोड़ा जाता है. इंजेक्शन जानवर और उजागर भ्रूण अल्ट्रासाउंड (Figure1A) जांच के लिए गर्भाशय की दीवार (Figure1B) के माध्यम से उजागर भ्रूण की वास्तविक समय इमेजिंग बनाने के तहत युक्त मंच रखें. जांच तो पीबीएस स्नान में है motorized नियंत्रण का उपयोग imaged किया जा भ्रूण पर सीधे कम. छवियाँ जब जांच लगभग 2-3 मिमी भ्रूण से दूर प्राप्त किया जा सकता है. यह बहुत महत्वपूर्ण है को यकीन है कि जांच सिर भ्रूण हिट नहीं के रूप में इसे आगे और पीछे झूल के लिए छवियों को इकट्ठा करता है. * धारक माँ सर्जरी के दौरान टिकी हुई है आसानी से एक मशीन की दुकान के द्वारा बनाया जा सकता है है. यह दो plexiglass शीर्ष पर चिपके पक्षों के साथ एक विस्तृत plexiglass आधार है, और उनके बीच में एक स्थान (विस्तृत माउस के लिए करने के लिए पर्याप्त फिट है जबकि अपनी पीठ पर झूठ बोल) शामिल होना चाहिए. पक्षों ने उनमें से एक घाटी जमीन से बाहर है, जो तब काले मोम (जैसे एक विच्छेदन ट्रे से) के साथ भरा है होना चाहिए. वह मोम सामग्री के रूप में कार्य करता है जो थम्बपिन पीबीएस की थाली है कि भ्रूण में इंजेक्शन के दौरान स्नान कर रहे हैं पकड़ करने के लिए नीचे दबाया जाएगा. : ** 10cm बैक्टीरिया व्यंजन (व्यास में लगभग 2cm) नीचे के केंद्र (इस हैवी ड्यूटी पोर्टेबल पंच और एक 13/16 वें इंच परिपत्र मरने के साथ किया जा सकता से बाहर छिद्रित छेद होना चाहिए http://roperwhitney .com/punching/2-1011.cfm ). इसके अलावा, केन्द्र छेद के दोनों ओर (के बारे में दूर 1.5cm) दो छोटे छेद एक सुई लौ गर्म (या वे पाठ्यक्रम के एक ड्रिल के साथ बनाया जा सकता है) के साथ बाहर जला चाहिए. इन छेद तो वैक्यूम तेल के साथ कवर कर रहे हैं और जहां थम्बपिन कि धारक पर थाली पकड़ काले मोम में के माध्यम से धक्का करने के लिए किया जाएगा. वैक्यूम तेल बाहर लीक से पीबीएस को रोकने है. भाग 4. एक Microinjection सुई में वायरस लोड हो रहा है एक 1mm (भीतरी व्यास) beveling microinjection सुई फैशन खींच लिया गिलास केशिका. सुई के तीखेपन के लिए महत्वपूर्ण है, और एक अपर्याप्त तेज सुई के साथ काम गंभीरता से गर्भाशय की दीवार और amnionic थैली की पहुंच समझौता कर सकते हैं, और प्रयोगात्मक विफलता के लिए नेतृत्व कर सकते हैं. तेज सुई तो विंदुक धारक, जो एक 25 μL एक मैनुअल पंप जलसेक / वापसी (अन्य उपकरणों लोड हो रहा है और सुई के निर्वहन को विनियमित करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, लेकिन यह है क्या है में मुहिम शुरू की microsyringe टयूबिंग के माध्यम से जुड़ा है में रखा जाता है वीडियो में दिखाया गया है). इष्टतम जवाबदेही (विस्तार और संपीड़न एक हवा भर प्रणाली के साथ जुड़े से बचने के लिए) के लिए, microsyringe, टयूबिंग, और सुई खनिज तेल के साथ भरा जाना चाहिए. पहले सुई लोड हो रहा है यकीन है कि वहाँ सिरिंज से सिस्टम में कोई हवाई बुलबुले सुई की नोक के लिए सभी तरह कर रहे हैं बनाते हैं. फिर वापस सुई में एक छोटे से हवा बुलबुला (लंबाई में 1-2 मिमी) आकर्षित पहले वायरस लोड करने के लिए शुरू. यह हवा जेब वायरस और खनिज तेल के बीच अलगाव को बनाए रखने में मदद करता है. वायरल इंजेक्शन जा शेयर 0.08 मिलीग्राम / एमएल के एक अंतिम एकाग्रता (वायरस उत्पादन पर अधिक जानकारी के लिए कृपया संदर्भ 1, 2 को देखें) पर polybrene शामिल करना चाहिए. नोट है कि रेट्रोवायरल शेयरों केंद्रित आम तौर पर बात कण, जिसमें संक्रामक सामग्री के बहुमत का एक महत्वपूर्ण राशि शामिल है, और तो बाहर एक 5 के बिना नहीं फ़िल्टर्ड किया जा सकता है – टिटर में 10 गुना ड्रॉप करने के लिए. इसके अलावा, तैयारी पर निर्भर करता है है, वायरल शेयर lysed पैकेजिंग कोशिकाओं के जीनोमिक डीएनए (293 कोशिकाओं का उपयोग करने के लिए / MLV VSV pseudotyped वायरस उत्पन्न विशेष रूप से सच है अगर) से चिपचिपा हो सकता है. यदि वायरस के विभाज्य चिपचिपा है, DNase की एक छोटी राशि मैं और शेयर ढीला करने के लिए जोड़ा जाना चाहिए कर सकते हैं, या सुई बेहद मुश्किल हो जाएगा लोड हो रहा है. एक वायरल शेयर (8-10 μL) की छोटी बूंद सुई लोड करने के लिए तैयारी में parafilm की एक बाँझ टुकड़ा पर रखा जाना चाहिए. फिर वापसी पंप का उपयोग सावधानी से ध्यान दे सुई लोड करने के लिए मोज़री से बचने. इंजेक्शन क्षेत्र में micromanipulator स्थिति में लोड सुई प्लेस, भ्रूण पर सुई, या अल्ट्रासाउंड जांच नहीं तोड़ सावधान किया जा रहा है. ध्यान दें कि अगर किसी कारण के लिए सुई काफी भरी हुई है पहले इंजेक्शन के लिए होते है यह मददगार हो सकता है टिप है, जो इंजेक्शन शुरू करने से पहले छुट्टी कर सकते हैं में हवा की एक छोटी राशि आकर्षित कर सकते हैं. यह हवा जेब वायरल शेयर (एक घटना है कि लगभग हमेशा कि भरी हुई सुई बेकार प्रस्तुत करना होगा) सुई की नोक पर सुखाने के खिलाफ की रक्षा कर सकते हैं. भाग 5. अल्ट्रासाउंड निर्देशित वायरल इंजेक्शन वीडियो मॉनीटर पर वास्तविक समय अल्ट्रासाउंड जांच के द्वारा बनाई गई छवि कल्पना है, और भ्रूण में microinjection सुई गाइड करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है. इस प्रणाली के वायरस का प्रयोग E8.5 पर amniotic थैली में इंजेक्ट किया जा सकता है या तो amniotic थैली या E9.5 E11.5 (Figure1B) से वेंट्रिकुलर सिस्टम. इस प्रक्रिया का सबसे कठिन हिस्सा है और अनुभव पर हाथ की एक महत्वपूर्ण राशि (5-20 घंटे के आधार पर अन्वेषक के आदेश पर) गुरु की आवश्यकता है. सुई टिप स्क्रीन पर प्रतिभाशाली स्थान के रूप में अल्ट्रासाउंड छवि में स्पष्ट है, और जांच की स्थिति का समायोजन (y और z विमानों में motorized नियंत्रण का उपयोग कर के साथ अनुसार में बढ़ रहा है देखा जाना चाहिए, और एक्स में मैनुअल नियंत्रण विमान). यह महत्वपूर्ण है कि जांच के दोलन दिशा सुई की लंबाई के समानांतर है. यह विश्वास दिलाता हूँ कि सुई टिप आंदोलनों के दौरान छवि विमान में रहता है यह भ्रूण में इंजेक्शन के लिए स्थिति. भ्रूण तैनात किया है जैसे कि लक्ष्य क्षेत्र (इस मामले अग्रमस्तिष्क निलय में) आसानी से दिखाई देता है और गर्भाशय सामग्री का इंजेक्शन रास्ते में कम से कम राशि के साथ सुई के लिए सुलभ है चाहिए. इसके अलावा, यह नाल के माध्यम से नहीं इंजेक्षन करने के लिए महत्वपूर्ण है. एक बार लक्ष्य मस्तिष्क क्षेत्र सुई उन्नति की दिशा (micromanipulator पर घुंडी का उपयोग) के साथ पंक्तिवाला है, सुई सिर्फ गर्भाशय की दीवार को छू, और चाहिए तो एक छोटी त्वरित प्रहार आगे ऊतक घुसना चाहिए. एक समान दृष्टिकोण amnionic थैली और फिर मस्तिष्क में प्रवेश करने के लिए प्रयोग किया जाता है. कुछ मामलों में, अनुभवी और अन्वेषक एक प्रस्ताव में वेंट्रिकल मारा, खासकर अगर सुई बहुत तेज है. यांत्रिकी, जांच, सुई, और भ्रूण (मंच पर माँ हिल द्वारा) ले जाने के हाथ – अभ्यास पर मास्टर की आवश्यकता है. एक बार भ्रूण की वांछित संख्या इंजेक्शन दिया गया है, 5.0 रेशम sutures के साथ पेट की दीवार के करीब है. suturing के यांत्रिकी इस प्रकार की सर्जरी के लिए विशिष्ट नहीं कर रहे हैं. अंत में, प्रधान त्वचा पशु autoclips पेट की मांसपेशियों में टांके पर एक साथ उपयोग. त्वचा suturing क्योंकि माउस बाहर टांके चबाना नहीं होगा की सिफारिश की है. Analgesia चीरा क्षेत्र के लिए लागू किया जाना चाहिए के लिए माउस के रूप में यह जागता द्वारा अनुभवी दर्द की मात्रा को कम. यह अनुशंसा की जाती है कि एक 0.25% Bupivacaine समाधान (0.8 मिलीलीटर / किग्रा, या 2 मिलीग्राम / किग्रा) इंजेक्शन subcutaneously चीरा साइट के साथ हर कुछ मिलीमीटर हो. जबकि माउस ठीक धीरे शोषक कागज पर एक साफ पिंजरे में एक जेल पैक (खिलाने और जलयोजन की सुविधा) युक्त पशु रखना. एक स्लाइड गर्म सेट पर 37 पिंजरे प्लेस डिग्री सेल्सियस शरीर का तापमान बनाए रखने के लिए. जब जागा, एक साफ पिंजरे में माउस और जेल पैक जगह है और जानवर रैक पर लौटने. अगले दिन किसी भी योनि से खून बह रहा, उदर संकुचन, और / या एक समग्र व्यथित देखो, जो सभी के गर्भपात से संकेत मिलता है के लिए माउस की जाँच करें. यदि यह मामला है, माउस तुरंत euthanize. अच्छी तरह से तैयार बाल और एक समग्र स्वस्थ उपस्थिति सर्जरी से सफल वसूली का संकेत मिलता है. इंजेक्शन भ्रूण के रूप में आगे के विश्लेषण के लिए के embryonically या postnatally बलिदान कर सकते हैं. यदि वायरस मानव क्षारीय (PLAP) फॉस्फेट या GFP के रूप में एक संवाददाता जीन, व्यक्त, एक धुंधला हो जाना सकारात्मक वायरल संक्रमण (Figure1C) के क्षेत्रों प्रकट होगा. प्रतिनिधि परिणाम इंजेक्ट भ्रूण 1-2 दिनों के बाद इंजेक्शन का बलिदान किया जा सकता है वयस्कता के माध्यम से सभी तरह. यदि वायरस PLAP या GFP जैसे एक पत्रकार जीन व्यक्त किया, तब संवाददाता अभिव्यक्ति virally संक्रमित कोशिकाओं और उन कोशिकाओं के क्लोन की पहचान करता है. उदाहरण के लिए, चित्र 1C में दिखाया गया है कि utero में E9.5 पर एक रेट्रोवायरल वेक्टर व्यक्त PLAP से संक्रमित किया गया था एक प्रसव के बाद मस्तिष्क के एक ऊतक अनुभाग है. संक्रमित कोशिकाओं histochemical धुंधला के बाद बैंगनी समूहों के रूप में कल्पना कर रहे हैं. Virally संक्रमित कोशिकाओं की पहचान करने के अलावा, संवाददाता अभिव्यक्ति एक सेल आकारिकी और स्थिति, के रूप में के रूप में अच्छी तरह से जीन अभिव्यक्ति की स्थिति की जांच करने के लिए अनुमति देता है. "NT> चित्रा 1 E9.5 माउस अग्रमस्तिष्क ventricles में वायरल इंजेक्शन. Anesthetized जानवर इंजेक्शन मंच पर रखा गया है. दो भ्रूण और उजागर किया जाएगा जहां संकेत (तीर) अल्ट्रासाउंड जांच के तहत तैनात हैं. microinjection वायरस से भरा सुई भ्रूण के निकट स्थित है और अल्ट्रासाउंड जांच के साथ पंक्तिवाला. बी स्क्रीन एक E9.5 माउस भ्रूण से वास्तविक समय एक अल्ट्रासाउंड छवि के कब्जा. वी, निलय, के रूप में, amniotic थैली, UW, गर्भाशय की दीवार. सी. भ्रूण PLAP-व्यक्त E10.5 पर एक वायरस के साथ अंतःक्षिप्त थे. PLAP लिए Histochemical धुंधला वायरल संक्रमण की घटनाओं के स्थान का पता चलता है.