1. Breve Descrição do Primer-Protocolos Livres Seleção Uma biblioteca de DNA double-stranded foi construído utilizando PCR com os oligonucleotídeos correspondente (Figura 1 e 2, Passo a), que contêm um domínio central aleatória de 30 nt, flanqueada por duas regiões primer. Protocolos de duas ligeiramente diferente "primer-free" (PF) foram desenvolvidos. Na biblioteca de dsDNA, a região 5'-contém uma endonuclease "nicking" site para o Nt.BstNBI endonuclease; esta enzima reconhece dsDNA mas cliva apenas uma vertente do substrato DNA. A região 3'-dsDNA da biblioteca contém outra "nicking" site, para a endonuclease Nt.BbvCI que também reconhece dsDNA mas cliva apenas um fio, deixando um CC na 3'end (PF 1), bem como um BspMI site de endonuclease de restrição, que cliva ambas as vertentes não deixando nenhum adicional de 3 'nucleotídeos (PF 2). Em geral, empregam o protocolo 1 PF inicialmente (porque é mais fácil separar fragmentos produzidos durante o processo de seleção, veja abaixo), e em seguida empregam o protocolo 2 PF para as rodadas subseqüentes da seleção. O nt 32 de 5'-pN30-CC-3 'fragmento (designados 32 + fragmento) ea nt 30 de 5'-pN30-3' fragmento (designados 30 + fragmento) foram, respectivamente, gerados por Nt.BbvCI / Nt . BstNBI ou BspMI / Nt.BstNBI clivagem da biblioteca dsDNA, eo gel de purificação. Os 32 + fragmento contém os 30 domínios nt aleatória, com uma seqüência CC de acompanhamento no final 3'-(PF 1). Os 30 + fragmento (PF 2) consiste apenas os 30 nt seqüência aleatória de domínio. A "auto-ponte" 66 – fragmento (contendo a região N30 aleatórios com o 5 'e 3' seqüências de acompanhamento) foi obtido pela purificação gel (Nt.BbvCI ou Nt.BstNBI corta somente a parte superior "+" strand). Esta auto-ponte é obtido diretamente no protocolo de um PF, ou pode ser gerado e isolado após o corte do DNA biblioteca com NtBbv.CI só ou Nt.BstNBI para a PF 2 do protocolo (Figura 1 e 2 Etapa b). Os 32 + – ou 32 +-fragmentos foram incubadas com as proteínas purificadas ou a células de melanoma cultivadas para permitir que os fragmentos se ligam às proteínas ou células, e, em seguida, os fragmentos foram lavados unbound (Figura 1 e 2, Passo c). Os fragmentos selecionados foram vinculados ou usada para re-geração das regiões primer. Na reação de hibridização / ligadura, a auto-ponte foi produzida e purificada, ao mesmo tempo como o 32 + – e 30 de purificação + fragmento; 5'-end cartilha foi mesmo a construção da biblioteca e 3'-end primers foram substituídas combinando com primers, que também continha um promotor de transcrição adicionais SP6 no final 3'-(Figura 1 e 2, Passo d). Os produtos da reação de hibridização / ligadura foram então usados ​​para a transcrição do RNA in vitro (Figura 1 e 2, e Step). Após a transcrição do RNA, o DNA ligado (incluindo o fragmento de DNA não selecionados auto-ponte) foram digeridos pela DNase I para remover seqüências de fundo interferir. A transcrição reversa (RT)-PCR dados mostraram que o primer-regenerado produtos foram eficientemente reamplified, constituindo um "round" da seleção (Figura 1 e 2, Passo f). A amplificação de fundo mostrado em números ciclo de alta no não-RT PCR controle pode ser completamente removido por um período adicional digestão eu DNase, e não é detectável após números mais baixos do ciclo, que rotineiramente utilizam. Após 7 rodadas de seleção, aptâmeros foram caracterizados por propriedades de ligação. Kd eram todos na faixa de 10 -7 M 10 -8 (Figura 3). Em ensaios de ligação, vários pares de aptâmeros mostrou ligação aditivo, indicando que eles têm como alvo locais distintos sobre a proteína S100B. Por isso, testou pares de aptâmeros em "sanduíche" ensaios de ligação, tanto em microarrays de vidro (slides CodeLink), utilizando-fluorescente etiquetados aptâmeros segundo, e sobre nanofios de ouro derivatizada com aptâmeros segundo acoplado a 50 nm nanopartículas de ouro (AuNPs; Figura 3). Em ambos os casos, a especificidade de ligação foi alta: On microarrays CodeLink, não vinculativo sanduíche foi observada com aptâmeros que não apresentem aditivo obrigatório em determinações Kd. Com nanofios derivatizado observamos praticamente sem ligação a proteínas não-alvo, e os complexos sanduíche individual pode ser observada através do AuNPs aptamer-coupled (Figura 3). 2. Materiais 2.1. Geração de PF Biblioteca DNA e reamplificação de Fragmentos Limite Detalhes estão descritos no Pan e Clawson, 2009; Pan et al, 2008.. 2.2. Purificada Seleção baseados em proteínas 20 mM Tris-HCl, pH 7,4 32 + Fragmento e 30 + Fragmento- Tampão de seleção (2,5 mM CaCl 2, 5 mM MgCl 2 em 1X Tampão fosfato salino, pH 7,4, Gibco) Ni-NTA Agarose Beads (Qiagen) Coluna de polipropileno (Qiagen) Tampão de ligação (50 mM Na 2HPO 4-NaH 2 PO 4, pH7.2, 150 mM NaCl) Expressa, purificada proteína S100B em tampão de ligação (5 mg / mL) Fenol: CHCl3: IAA (pH 7,9, Ambion) 3 M NAAC, pH 5,2 100%, e etanol 70% 2.3. TOPO Clonagem e Análise de sequenciamento das bibliotecas selecionadas dsDNA 7 ª rodada produtos selecionados PCR (rodadas adicionais podem ser realizados para continuar otimização de aptamer obrigatório) pCR2.1-TOPO Vector (Invitrogen) DH5 Células Componente (Invitrogen) Plasmídeo Mini Kit (Qiagen) M13 cartilha para a frente Vector Informax do NTI (Invitrogen) 2.4. Características ligação do Aptamers Aptâmeros e controle oligos (CC N 30 e N 30, IDT) Quinase Polinucleotídeo T4 (New England Biolabs) γ-32 P-ATP (3000 Ci mmol /; 10 μCi / ml) Purificada S100B em tampão de ligação (5 mg / mL) 2.5. Ensaios Sandwich vinculação com a proteína S100B purificada e Aptamers selecionados O 1 º aptamer foi acoplado a qualquer a.) nanofios slides CodeLink microarray ou b.) Au. Proteína purificada S100B, diluído ou 0,125 M em 70 mL de uma) ou 1 M em 50 ul para b). O 2 º aptamer ou era rotulado com a.) Alexafluor 546 para o conjunto CodeLink slides, ou b.) acoplado a 50 AuNPs nm para os estudos com nanofios de Au derivatizado. 3. Métodos 3.1. Geração de PF DNA Biblioteca Métodos e protocolos detalhados para a seleção aptamer podem ser encontrados no Pan e Clawson, 2009; Pan et al, 2008.. 3.2. Aptamer Seleção usando proteína purificada S100B Humana cálcio S100 ligação às proteínas B (S100B. Gene ID # 6285) foi usado como alvo. O 6-tagged Sua proteína S100B (98 aminoácidos de comprimento) foi expressa e purificada usando o sistema de QIAexpressionist. (QIAGEN). Se desejado ou indicados, o seu 6 tag pode ser removida enzimaticamente. Durante as rodadas de seleção, uma amostra mL de cada etapa foi salvo por cintilação líquida de contagem para determinar a eficiência global de ligação. 3.2.1. Preparação de DNA-PF Biblioteca Fragments Re-suspender a + 32 e 30 fragmentos + em 40 mL de 20 mM Tris-HCl, pH 7.4. 3 min de calor a 85 ° C, e arrefecer a 37 ° C por 3 min em uma incubadora de 37 ° C. Adicionar 760 mL de tampão de seleção (2,5 mM CaCl 2, 5 mM MgCl 2 em 1X Tampão fosfato salino, pH 7,4, GIBCO) e incubar por 3 min a 37 ° C, em seguida, manter a temperatura ambiente (RT) por 10 min. Passar por uma coluna continha Ni-NTA agarose-beads (QIAGEN), pré-lavadas com tampão de seleção, em seguida, manter em temperatura ambiente até o uso. 3.2.2. Preparação de S100B Agarose-Bead Ni-NTA Limite na RT Girar 400 mL de contas Ni-NTA agarose por 3 seg e desprezar o sobrenadante. Lave as contas com 400 mL de tampão de ligação (50 mM Na 2 HPO 4-NaH 2 PO 4, pH7.2, 150 mM NaCl) com cuidado pipetando cinco vezes, então spin down e desprezar o sobrenadante. Repita o passo 2 duas vezes. Adicionar 400 mL de S100B purificada (5 mg / mL, suspenso em tampão de ligação) e gentilmente pipeta 5 vezes a cada 3 minutos para o total de 15 min. Spin down e desprezar o sobrenadante. Lave o S100B talão-bound com 400 mL de tampão de ligação com cuidado pipetando 3 vezes, então spin down e desprezar o sobrenadante. Repita a etapa 6 duas vezes. 3.2.3. Seleção de S100B-bound Aptamers Transferir a + 32 – 30 + e-fragmentos da 3.2.1 para a S100B bead-bound. Incubar por 15 min e misture delicadamente a cada 3 minutos, pipetando com cuidado. Lavar o complexo DNA-S100B com 800 mL de tampão de ligação com cuidado pipetando, então spin down e desprezar o sobrenadante. Repita a etapa 3 duas vezes. 3.2.4. Recuperação da Aptamers S100B-selecionados Adicionar 200 mL 20 mM Tris-HCl (pH7.4), min calor 3 a 85 ° C, vortex min 1 e spin down, em seguida, transferir o sobrenadante para um novo tubo. Repita o passo 1 vez, e combinar o supernates. Purificar o DNA-selecionados fragmentos como passos por 12/09 de publicações anteriores (11, 12). 3.2.5. TOPO clonagem e sequenciamento de análise para identificação de sequências Aptamer Consenso Clone da 10 ª rodada selecionados produtos de PCR em pCR2.1-TOPO de vetores (de Invitrogen). Adicionalclonagem pode ser feito como outras seleções são realizadas. Seqüência de 40-50 colônias único com M13 cartilha para a frente (usamos o Facility Núcleo de Genética Molecular na Faculdade de Medicina Hershey Center). Alinhamento das seqüências selecionadas usando Vector Informax do NTI (Invitrogen). Determinar as seqüências consenso com base em alinhamentos. Aptâmeros consenso foram, então, comprado de Tecnologias de DNA Integrada. 3.3. Ensaios sanduíche de vinculação com pares de Aptamers selecionados 3.3.1. Microarray formato usando fluorescente etiquetado 2 aptâmeros nd. Aptamers consenso 1 º foram sintetizados com uma porção 5'-amineC6. Eles foram suspensos em tampão de impressão para uma concentração final de 15 mM e malhados em Slides CodeLink Ativado (GE Healthcare / Amersham Biosciences) usando um Apogent Descobrimentos microgrid Arrayer no DNA Microarray instalação PSU, University Park), seguindo os protocolos CodeLink recomendado. Cada lâmina foi impressa com 12 matrizes. Hibridização foi realizada em um formato cassete 2 8 x Hibridação Microarray (Array It, TeleChem Internacional). O Cassette Microarray foi selada com nuclease livre de folha de vedação adesiva (AlumaSeal II, Research Products International) para evitar a evaporação. Proteína S100B foi diluído em PBS a concentração adequada em 70 mL e aplicados aos poços da cassete de microarray. Ligação ao aptâmeros impresso no slide CodeLink foi por 1 hora à temperatura ambiente. Os poços da cassete foram então lavadas individualmente 3X com PBS + 5 mM MgCl 2 (PBSM), e excesso de tampão de lavagem foi apagado. O aptâmeros fluorescente etiquetado foram diluídas em PBSM a 0,125 M em 70 mL, em seguida, aquecida a 85 ° C por 3 minutos seguidos de 3 minutos no gelo. Aptâmeros foram aplicadas aos poços da cassete de microarray, e incubados por uma hora em temperatura ambiente. Poços foram novamente lavados individualmente 3X com PBSM. A cassete foi então desmontado, ad toda a lâmina foi lavada em PBSM. A lâmina foi então completamente secas por centrifugação, e digitalizados usando um Scanning Packard Biosciences ScanArray 4000XL (Perkin Elmer). 3.3.2. Formato Nanowire derivatizados usando 2 aptâmeros nd acoplado a 50 nm AuNPs Ouro NWS (~ 5 M de comprimento, 320 nm de diâmetro) foram sintetizados por eletrodeposição galvanostático dentro de membranas de alumina porosa seguintes protocolos publicados anteriormente (13, 14). Após a dissolução da membrana porosa, os nanofios foram ressuspendidos em 1 mL de etanol. Como se observa, o DNA foi comprado de Tecnologias de DNA Integrada. Nanopartículas de ouro (50 nm) foram adquiridas da Ted Pella. DNA foi clivada Thiolated com 100 mM DTT em 0,1 M fosfato de sódio pH 8,3 por uma hora e depois purificada em um spin-Centri 10 coluna. Aptamer apego à NWS Ouro e NPs A alíquota de 50 mL de nanofios de Au foi colocado em um tubo de centrífuga de 0,5 mL antiaderente e lavadas em tampão fosfato 10 mM, 300 mM NaCl, pH 7.4. DNA thiolated na extremidade 5 '(com um espaçador T 10 na extremidade 5') foi adicionado na concentração final de 0,4 mM para os fios. A amostra foi agitadas por 30 min e depois lavados por centrifugação (8100 g), três vezes com o tampão fosfato 10 mM, 300 mM NaCl, pH 7,4 e três vezes com tampão fosfato 50 mM, 5 mM MgCl 2, pH 7.2. Os fios de DNA revestido foram ressuspensos em 100 mL de buffer para diluir pela metade. DNA-derivatizado AuNPs foram preparadas pela adição de 50 ul 100 mM 2 º aptamer (com um espaçador de 10 T no final 5'-) a 1 mL 50 AuNPs nm e aquecida a 37 ° C durante uma hora. Após o aquecimento, 10 mM tampão fosfato de sódio, NaCl 1M, pH 7,4, foi adicionado (25 mL duas vezes, seguido por 100 mL, 150 mL e 128 mL) em intervalos de 0,5 horas. Os conjugados foram deixados em um bloco de aquecimento 37 ° C durante a noite antes de usar. As amostras foram lavadas 3 vezes com tampão fosfato 50 mM, 5 mM MgCl 2, pH 7.2. Conjugados foram ressuspensos em 120 mL de buffer. Hibridação sanduíche em NWS Fios de DNA revestido, 1 mL diluída, foram adicionados ao tampão em tubos de PCR. S100B proteína ou proteína HtrA1 controle (1 mg / mL) foi adicionado para uma concentração final de 1 mM em 50 mL de buffer (~ 10-12 moléculas de proteína adicionada por nanómetro quadrados de superfície de Au nanofio). As amostras foram agitadas por aproximadamente 2 horas. Fios foram lavadas por centrifugação (8100 g) três vezes com tampão fosfato 50 mM, 5 mM MgCl 2, pH 7,2 e foram cada ressuspenso em 20 mL AUNP / DNA conjugados. Os fios foram agitadas no conjugados para 2 hr, e depois foram lavadas 5x por centrifugação (1300 g) com tampão fosfato 50 mM, 5 mM MgCl 2, pH 7,2 para remover o excesso de nanopartículas. As amostras foram ressuspendidas em20 mL de buffer e secas em wafers de Si Au revestido para FE-SEM análise. FE-SEM imagens dos nanofios foram obtidos utilizando um Leo Field Emission 1530 Microscópio Eletrônico de Varredura usando um Schottky fonte de elétrons de emissão de campo a uma tensão de funcionamento 5,00 kV. 4. Resultados representante Figura 1. Protocolos do Primer 5'-Free (PF 1) e Primer-Free (PF 2). (A) A PF um protocolo de seleção DNA aptamer. A biblioteca de oligonucleotídeos são recozidos em conjunto, e submetido a PCR para produzir uma biblioteca de DNA de fita dupla (a). A 5'-end região primário-free (PF 1) aleatoriamente da PF bibliotecas single-stranded DNA é preparada por Nt.BstNBI / Nt.BbvCI digestões (sítios de clivagem são marcadas com setas vermelhas) e gel de purificações, e os auto- -bridge (seta preta) é isolada por purificação gel (b). Após a seleção (c), as seqüências selecionada (designada PS30-CC) são cruzados com os seus oligômeros correspondente ea auto-ponte e ligados à re-gerar a cartilha regiões previamente removido. Nesta fase, são introduzidas primers que contêm um promotor SP6 no final 3'-(d). Este é então usado para transcrever RNA contendo as regiões selecionadas (e). Finalmente, o RNA é então exclusivamente re-amplificado (o DNA é digerido template) usando RT-PCR (f), e os selecionados sub-biblioteca está pronta para a próxima rodada de seleção. (B) O protocolo de seleção PF 2 aptamer DNA. A biblioteca de oligonucleotídeos são recozidos juntos e submetido a PCR para produzir uma biblioteca de DNA de fita dupla (a). A região de primer-free (PF 2) aleatórios da biblioteca de DNA de fita simples PF é preparada por Nt.BstNBI / BspMI digestões (sites de corte são indicadas por setas) e de purificação de gel. A auto-ponte seja isolado, quer o protocolo 1 PF e / ou por digestão único da biblioteca começando com Nt.BstNBI (b), juntamente com a purificação em gel. Após a seleção (c), as seqüências selecionada (designada PS30) são cruzados com os seus oligômeros correspondente ea auto-ponte, e ligados para regenerar as regiões de primer previamente removido. Como em um PF, primers são introduzidos que contêm um promotor SP6 no final de 3'(d). Este é então usado para transcrever RNA contendo as regiões selecionadas (e). O RNA é então exclusivamente reamplified usando RT-PCR (f), e os selecionados sub-biblioteca está pronta para a próxima rodada de seleção. Figura 2. Representação esquemática e resultados experimentais / redução para a prática do protocolo de seleção PF. Designada passos correspondem aos retratados na Figura 1. Após a digestão da biblioteca PF construído por PCR (Passo a) com endonucleases de restrição (como indicado), os produtos digeridos foram separados por PAGE em gel 10% em condições desnaturantes. Os fragmentos correspondentes obtidos com a PF PF 1 e 2 são mostrados os protocolos de seleção (etapa b). Após a seleção (etapa c), a aptâmeros vinculados são cruzados com os seus oligômeros correspondente ea auto-ponte, e ligados para regenerar as regiões de primer previamente removido. No final de 3', primers são introduzidos que contêm um promotor SP6 no final de 3'(Passo d). RNAs 32 P-rotulados foram transcritas usando produtos ligados de 1, 0,5, 0,25, 0,125 mL de 5 mL reações, e foram separadas por PAGE em gel de 6% em condições de desnaturação (e Step). As transcrições foram, então, tratados com DNase de removido o DNA não selecionadas regiões aleatórias, reverso transcrito em cDNA, e depois reamplified para ciclos de 7, 14, 21 ou 28 PCR. Os produtos foram separados por PAGE em gel de 8% sob condições não-desnaturante. Os 66 fragmentos nt representa o produto full-length contendo os selecionados PS30 PS30 CC-e seqüências como re-incorporado ao 5 'e 3' seqüências de acompanhamento. Migração de marcadores PhiX174/HinfI é mostrado à esquerda (Passo f). Controles incluídos omissão da etapa de transcrição reversa (RT). Uma pequena quantidade do produto em tais amostras pode ser visto em números ciclo de alta, o que, presumivelmente, podem ser completamente eliminados com uma segunda etapa de digestão (ou prolongada) DNase. Figura 3. Características ligação de Aptamers selecionados e seus Use emparelhados em um formato de sanduíche. A. dependente da concentração 32 Binding P Aptamer para Determinação Kd. Aptâmeros foram final-5'rotulados com g-32 P-ATP (3000Ci/mmol, ~ 10 mCi) e Quinase Polinucleotídeo T4 (New England Biolabs), e wa vinculativos determinado conforme descrito. B. 5'-amina-derivatizado 1 ª aptâmeros foram acoplados a CodeLink microarrays. Proteína purificada S100B foi vinculado à 1 ª aptamer, as lâminas foram lavadas exaustivamente, e AlexaFluor546 marcado 2 º aptamer foi vinculado à 1 ª aptamer: Complexos de S100B. Depois através de lavagem, fluorescência foi quantificada usando um scanner ScanArray. C. 5'-tiol derivatizado 1 ª aptâmeros foram acoplados a nanofios de Au usando química tiol padrão. 2 nd aptâmeros foram acoplados a 50 nm AuNPs da mesma maneira. Proteína purificada S100B (esquerda) ou proteína purificada controle HtrA1 (à direita) foi então ligado primeiro para os nanofios derivatizado. Depois de uma lavagem completa, 2 º aptamer-50 AuNPs nm foram posteriormente vinculados ao 1 º-aptamer-nanofio: Complexos de S100B. Depois através de lavagem, complexos sanduíche vinculados foram visualizados usando de emissão de campo microscopia eletrônica de varredura. Barra de escala = 1 mícron.