המשימה esiRNA עבור הקרנת RNAi בתאי יונקים
Summary
כאן אנו להשתמש בספריית esiRNA האדם המסך תפוקה גבוהה עבור גנים המעורבים חלוקת התא. אנו מדגימים כיצד להקים ולנהל מסכי esiRNA, וכן כיצד לנתח ולאמת את התוצאות.
Abstract
התערבות RNA (RNAi) הוא מנגנון בסיסי הסלולר לבקרה של ביטוי גנים. RNAi הוא המושרה על ידי פעמיים תקועים RNAs קצר הידוע גם בשם RNAs התערבות קטנה (siRNAs). קצר פעמיים תקועים RNAs מקורן יותר מבשרי גדילי כפול על ידי פעילות של דייסר, חלבון ממשפחת RNase III של endonucleases. שברי וכתוצאה מכך הם מרכיבים של RNA-Induced השתקה מורכבות (RISC), בהכוונת אותו mRNA המטרה מאותו מקור. RISC cleaves את ה-mRNA היעד ובכך להפחית את הביטוי של החלבון המקודד 1,2,3. RNAi הפכה שיטה ניסיונית עוצמה בשימוש נרחב עבור אובדן של מחקרים לתפקד גנים בתאי יונקים ניצול RNAs התערבות קטנה.
כיום שתי שיטות עיקריות זמינים לייצור RNAs התערבות קטנה. שיטה אחת כרוכה סינתזה כימית, ואילו שיטה חלופית מעסיקה מחשוף endonucleolytic של יעד ספציפי פעמיים תקועים RNAs ארוך על ידי RNase III במבחנה. ובכך, בריכה מגוונת של siRNA כמו oligonucleotides מיוצר אשר ידוע גם בשם-siRNA endoribonuclease מוכן או esiRNA. השוואה של היעילות של siRNAs ו esiRNAs נגזרת כימית מראה מעורר הן עוצמה והשתקת מטרה גן. הבדלים עם זאת, ניתן לראות כאשר משווים סגוליות. רבים siRNAs מסונתז כימי יחיד לייצר בולטות מחוץ היעד תופעות, ואילו תערובת מורכבת הטמון esiRNAs מוביל מציאה ספציפי יותר 10.
במחקר זה, אנו מציגים את העיצוב של הגנום בקנה מידה esiRNA ספריות המשימה וניצול שלו להקרנה RNAi לידי ביטוי במסך ה-DNA תוכן לזיהוי גנים המעורבים התקדמות מחזור התא. אנחנו מראים איך לייעל את פרוטוקול transfection ואת assay להקרנה של תפוקה גבוהה. אנחנו גם מדגימים כיצד נתונים גדולים מגדיר ניתן להעריך סטטיסטית ולהציג שיטות לאימות להיטים העיקרי. לבסוף, אנחנו נותנים נקודות מוצא פוטנציאל אפיונים תפקודית נוספת של להיטים תוקף.
Protocol
Discussion
התערבות RNA הפך טכניקה סטנדרטיים ללמוד הפסד של פונקציה פנוטיפים. בקנה מידה גדול אוספים של RNAi-מתווכים זמינים ספקים שונים ולספק שיטה קלה, חסכונית ומהירה על השתקה של גן. זה פתח את השער להקרנה שיטתית מפתח שחקנים תהליכים ביולוגיים רבים ומאפשר פרספקטיבה הגנום בקנה מידה על מגוון רחב של מינים שונים, סוגי תאים.
שיעורי גבוהה שווא שלילי חיובי כוזב הם אתגר משותף מסכי RNAi. כדי לטפל בבעיה זו, מאמצים רבים הושקעו על מנת לשפר את היעילות בפרט הספציפיות של השתקת מפעילה. התגלית החשובה הייתה בריכה של siRNAs שונה המיקוד התמליל זהה משפר באופן משמעותי את היעד הספציפיות. מכיוון בריכת מורכבת מאוד של siRNAs שונה מופק על ידי endoribonuclease, esiRNAs גבוהים סגוליות מעורר היעד, הפחתת שיעור חיובי כוזב מסכי RNAi. esiRNAs הוכיחו גם להשיג knockdowns יעיל, גם הפחתת שיעור שלילי כוזב.
מכיוון מסכי RNAi הם תובענית מבחינה טכנית, סביר להניח שהם יישארו מאתגר לבצע על בסיס קבוע במשך זמן מה. עם זאת, כפי ריאגנטים ומכשירים מעבדות לקבל יותר ויותר לשתף את מומחיותם, השימוש במסכים RNAi בביולוגיה המודרנית נחשבים להגדיל בעתיד.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
ברצוננו להודות לחברי מעבדה בוכהולץ ואת סיגמא אולדריץ RNAi צוות לדיון. ברצוננו להודות מקס פלאנק החברה ואת für Bundesministerium Bildung und Forschung Grands Go-Bio [0315105] לתמיכה.
MISSION ® הינו סימן מסחרי רשום של סיגמא אולדריץ ביוטכנולוגיה LP
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comments |
| MISSION esiRNA | Sigma-Aldrich | For additional information contact: rnai@sial.com | ||
| Wellmate | ThermoScientific | |||
| Breathable sealing tape | Corning | Breathable Sealing Tape, Sterile (Product #3345) | ||
| OptiMEM | Invitrogen | |||
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | 200 proof (absolute), for molecular biology | |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P5493 | BioReagent, 10x concentrate, suitable for cell culture, for molecular biology | |
| 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride | Sigma-Aldrich | D8417 | Poweder, BioReagent, suitable for cell culture, >98% (HPLC and TLC) | |
| Ribonuclease A from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | R6513 | For molecular biology, ≥70 Kunitz units/mg protein, lyophilized powder | |
| Tris-EDTA buffer solution | Sigma-Aldrich | T9285 | 100 x, for molecular biology |
References
- Ghildiyal, M., Zamore, P. D. Small silencing RNAs: an expanding universe. Nat Rev Genet. 10, 94-108 (2009).
- Jackson, A. L. Expression profiling reveals off-target gene regulation by RNAi. Nat Biotechnol. 21, 635-637 (2003).
- Echeverri, C. J. Minimizing the risk of reporting false positives in large-scale RNAi screens. Nat Methods. 3, 777-779 (2006).
- Henschel, A., Buchholz, F., Habermann, B. DEQOR: a web-based tool for the design and quality control of siRNAs. Nucleic Acids Res. 32, W113-W120 (2004).
- Kittler, R., Pelletier, L., Buchholz, F. Systems biology of mammalian cell division. Cell Cycle. 7, 2123-2128 (2008).
- Kittler, R. Genome-scale RNAi profiling of cell division in human tissue culture cells. Nat Cell Biol. 9, 1401-1412 (2007).
- Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J Biomol Screen. 4, 67-73 (1999).
- Malo, N., Hanley, J. A., Cerquozzi, S., Pelletier, J., Nadon, R. Statistical practice in high-throughput screening data analysis. Nat Biotechnol. 24, 167-175 (2006).
- Kittler, R. RNA interference rescue by bacterial artificial chromosome transgenesis in mammalian tissue culture cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 2396-2401 (2005).
- Kittler, R. Genome-wide resources for endoribonuclease-prepared short interfering RNAs for specific loss-of-function studies. Nat Methods. 4, 337-344 (2007).
