MISSIE esiRNA voor RNAi Screening in zoogdiercellen

1. Van hoge kwaliteit MISSIE esiRNA bibliotheken Voor elke gen van belang de meest gevoelige en specifieke doelgroepen regio voor RNAi is gekozen gebruik te maken van de DEQOR algoritme (http://cluster-1.mpi-cbg.de/Deqor/deqor.html). DEQOR 4 scoort het zwijgen op te leggen potentieel van alle mogelijk 21 nucleotiden lang siRNA's in een doel-mRNA gebaseerd op state-of-the-art design-beperkingen 4. Daarnaast wordt elke potentiële siRNA geanalyseerd op mogelijke cross-reactiviteit met andere genen door het uitvoeren van een BLAST search tegen het transcriptoom van het organisme bestudeerd. Het programma biedt daarbij een analyse van de algehele kwaliteit en cross-zwijgen capaciteiten van de potentiële esiRNA (300-600 bp lengte). De gekozen gebied van het target-gen cDNA wordt geamplificeerd door PCR met behulp van gen-specifieke primers geflankeerd door bacteriofaag RNA-polymerase-promoter sequenties. Elke PCR-product dat wordt gebruikt voor Mission esiRNA productie is geverifieerd voor de identiteit van sequencing en voor zuiverheid Caliper Labchip analyse. Lange double-stranded RNA wordt getranscribeerd van de PCR-product door RNA-polymerase, gevolgd door een gloeien van de getranscribeerde strengen. esiRNAs worden voorbereid door beperkte enzymatische afbraak van de lange double-stranded RNA met behulp van RNaseIII gevolgd door zuivering via anion-uitwisseling chromatografie gebruik te maken van Q-sepharose spin-kolommen. esiRNAs zijn neergeslagen en geresuspendeerd in TE-buffer. De opbrengst wordt gemeten door UV-absorptie metingen en de concentratie wordt aangepast door het oplossen in een geschikt volume van TE-buffer. De algehele kwaliteit van het eindproduct wordt gecontroleerd door Remklauw Labchip analyse. 2. Het kiezen van een cellijn en het optimaliseren van transfectie voor het screenen van Titreer hoeveelheden esiRNA (gebruik Eg5 als positief en renilla-luciferase als negatieve controle) en de steeds grotere hoeveelheden van de transfectie reagens in een 384-wells plaat, toe te voegen cellen en incubeer gedurende 48 uur. Eg5 is een kinesine motor eiwitten die nodig zijn voor een bipolaire assemblage van de spoel en de uitputting leidt tot een mitotische arresteren. Herhaal deze procedure voor verschillende transfectiereagentia en cellijnen. Hier gebruiken we HeLa cellen gekweekt volgens standaard procedures en oligofectamine (Invitrogen) als transfectiereagens. Voor het kiezen van de optimale transfectie voorwaarden tel de cellen getransfecteerd met Eg5 esiRNAs dat een mitotische arrestatie (ronde vorm) en het totale aantal cellen getransfecteerd met renilla-luciferase (RLUC) esiRNA met lichtmicroscopie show. Kies de conditie met de minste toxiciteit voor RLUC en de meest uitgesproken fenotype voor Eg5. Een alternatieve methode voor het optimaliseren van transfectie omstandigheden gaat om een ​​stabiele cellijn die EGFP (of een ander geschikt reportergen) onder de controle van een constitutieve actieve promotor. Na transfectie van een esiRNA tegen EGFP (of een ander reportergen) en RLUC (of een ander geschikt negatieve controle esiRNA) te meten knock-down werkzaamheid en de toxiciteit door bijvoorbeeld fluorescentie bijgestaan ​​celsortering (FACS). Zorg ervoor dat de gebruikte esiRNA voor EGFP is volledig complementair aan het doel-mRNA. 3. Instellen van de primaire scherm 5,6 Optimaliseer de pipetteren nauwkeurigheid voor alle gebruikte componenten op een geautomatiseerde pipetteren station (bijvoorbeeld Aquarius, Tecan en WellMate, Matrix). Omdat pipetteren parameters te wijzigen afhankelijk van het type van de oplossing, het volume en de plaat het type deze optimalisatie moet worden herhaald voor elke stap afzonderlijk. Indien mogelijk, moet het pipetteren station worden geplaatst onder een laminaire stroming kap verontreinigingen te voorkomen. Alle gebruikte onderdelen moeten worden opgeschoond voor gebruik hetzij door autoclaveren indien van toepassing of door te besproeien met 75% ethanol. Optimaliseer wash-protocollen, zodat kruisbesmetting van goed tot goed is uitgesloten. Details voor het optimaliseren van geautomatiseerde pipetteren kan niet worden geven voor de ruimte-beperkingen en grotendeels op de gebruikte pipetteren station hangen. Voor verdere informatie wordt verwezen naar de fabrikanten protocol. Transfecteren cellen in 384-wells formaat met behulp van de geoptimaliseerde omstandigheden van boven met esiRNAs voor Eg5 en RLUC. Gebruik een afwisselend patroon voor Eg5 en RLUC esiRNA voor de hele plaat. Na incubatie gedurende 48 uur de cellen herstellen met koude 100% ethanol, hydrateren in PBS gedurende 15 minuten, vlek 25 minuten in PBS met 1 ug / ml DAPI en 100 ug / ml RNase A (Qiagen). Tenslotte wassen met PBS en bewaar bij 4 ° C. Meten de intensiteit van de DAPI-fluorescentie microscopie door bijvoorbeeld op een Olympus ScanR systeem. Het genereren van een histogram door het plotten DAPI intensiteit tegen het aantal cellen en evalueren van de celcyclus verdeling door de berekening van het percentage cellen met het DNA-gehalte 2N voor de G1-fase; <2N> 4N voor de S-fase, 4N voor G2/M-phase en > 4N voor aneuploïdie / polyploïdie. Evalueer de homogeniteit van de resultaten over het bord. Verdere optimalisatie is nodig als de resultaten significant verschillen naar positie effe uit te sluitencts. Een veel voorkomend probleem bij het gebruik van multi-well platen wordt versterkt verdamping aan de rand putten tijdens incubatie tijd. Dit leidt tot verschillende experimentele condities in verschillende bronnen, die vaak vertaalt zich in plaat-positie specifieke effecten. Om deze reden adviseren wij om alle rand putten leeg voor een scherm te verlaten. Om verder te minimaliseren verdamping te zorgen dat de couveuses worden gehouden bij hoge luchtvochtigheid. We hebben ook regelmatig dienst verdamping barrières zoals Corning ademend Sealing Tape die verdamping te blokkeren. Ook andere middelen voor positie-effecten moeten worden gehouden, bv. technische variant van de uitlezing systeem (microscoop, plaat lezer, enz.) of variaties in de liquid handling (hellingen, inhomogeniteit van oplossingen, enz.). De statistische verschillen tussen de positieve en negatieve controles een maat voor de betekenis van de gebruikte test. Een groot verschil tussen de negatieve controle (of achtergrond lawaai; mock-control) en monster moet worden vastgesteld voordat de eigenlijke screening. Een goede maat voor de statistische significantie is de Z-factor. De Z-factor wordt berekend volgens de formule: Z = 1 – (3 SD [voorbeeld] + 3 SD [mock]) * (| Av [voorbeeld] – Av [mock] |) -1; met SD: standaarddeviatie; Av: gemiddeld. Een Z-factor van 1> Z> 0,5 wijst op een statistisch significante scheiding van negatieve controles (en geluid) van de positieve controles 7. 4. Primaire scherm Bereid 384-well kultuur platen voor transfectie van esiRNAs gebruik te maken van de optimale condities van boven. Hier gebruiken we 15ng esiRNA per goed opgelost in 5μl TE-buffer. Ten minste acht controle posities per plaat dient te worden geladen met de juiste positieve en negatieve controles voor de bestudeerde biologische proces (hier: Eg5 en RLUC). Om te voorkomen dat positie-effecten de rand putten worden geladen met 5μl TE-buffer alleen. Voeg 5μl OptiMEM (Invitrogen) met 0.2μl Oligofectamine per goed, meng en incubeer gedurende 20 minuten bij kamertemperatuur. Voeg celsuspensie op de transfectie-mengsel (hier: 40μl van een HeLa celsuspensie bij 25 cellen / ul concentratie, overeenkomend met 1000 cellen per well) en incubeer gedurende 72 uur. Meet DNA-inhoud op een geautomatiseerde microscoop (Olympus ScanR, zie boven). Evalueer met behulp van Z-score statistieken voor hit selectie: Z-scores zijn berekend voor alle monster esiRNAs met behulp van het signaal voor de negatieve controle als referentie. Let op, de Z-score is niet hetzelfde als de Z-factor. Z-scores geven een statistische maat voor de significantie van het monster waarden in vergelijking met een (schijn-) controle. Het is berekend volgens de formule: Z = (waarde [Sample] – gemiddelde [mock]) * standaard-deviatie [mock] -1. Voor de hit selectie een drempel moet worden toegepast. Typisch, een betekenis criteria zoals: 2 <Z <-2 is gebruikt, maar afhankelijk van de kwaliteit van de dataset, de bestudeerde biologische proces of simpelweg de omvang van het scherm, verschillende drempels van toepassing kan zijn. Naast de vrij gemakkelijk Z-score statistieken ook meer uitgebreide wiskundige evaluatie methoden kunnen worden gebruikt (een eerste binnen in het brede gebied van de statistische evaluatie van de screening gegevens zijn te vinden in Malo et al.. 8). 5. Tweede scherm en druk op validatie Een tweede scherm volgt de primaire scherm om valse positieven te wijten aan experimentele fouten of off-target effecten te elimineren. Voor de geselecteerde raakt dezelfde procedure als die bij de eerste scherm moet worden herhaald voor een groter aantal herhalingen (3-5) tot een betere statistische evaluatie mogelijk te maken. Voor geverifieerd raakt een secundair niet-overlappende esiRNA (of een andere niet-overlappende silencing trigger) ten opzichte van de doelstellingen die in de eerste schermen worden gebruikt. Dezelfde test en lees-out moet worden toegepast als voor de primaire scherm. Uiteindelijk is de geselecteerde genen kunnen worden gevalideerd door cross-soort RNAi te redden 9. Daardoor een bacteriële kunstmatig chromosoom (BAC) codering bijvoorbeeld de muis ortholog van het gen is stabiel getransfecteerd in cellen. BAC-construeert het behoud van een gen in zijn genoom context en zorgen voor een bijna-fysiologische expressie. RNAi tegen de endogeen humaan gen zal verlaten met de muis transgenexpressie onveranderd waarin de RNAi-fenotype reddingen. RNAi-rescue levert de gouden standaard voor de controle van RNAi fenotypes beschikbaar zijn tot op heden. Ten slotte worden de gevalideerde kandidaten in meer detail bestudeerd om uiteindelijk leiden mechanistisch begrip. In vele gevallen RNAi kan worden gebruikt in deze experimenten, bijvoorbeeld in het voortgezet, meer uitgebreide testen.