在哺乳动物细胞的RNAi筛选使命esiRNA

1。高品质的使命esiRNA库对于每一个感兴趣的基因的RNAi最敏感和最具体的目标区域是选择利用DEQOR算法（http://cluster-1.mpi-cbg.de/Deqor/deqor.html）4。DEQOR分数所有的沉默潜力可能21目标的mRNA核苷酸长的siRNA基于国家的最先进的设计约束4。此外，每一个潜在的siRNA是执行BLAST搜索对有机体的转录研究分析可能与其他基因的交叉反应。该方案，从而提供了一个分析的潜在esiRNA（300-600 bp的长度）的整体素质和跨沉默的能力。 选择区域的目标基因的cDNA使用两旁的噬菌体RNA聚合酶启动子序列的基因特异引物进行PCR扩增。 每任务esiRNA生产所用的PCR产物是核实身份，经测序和纯度卡尺Labchip分析。 长双链RNA是由RNA聚合酶的转录链退火，转录PCR产品。 esiRNAs准备长期使用RNaseIII随后通过阴离子交换色谱法，利用Q -琼脂糖凝胶离心柱纯化的双链核糖核酸酶消化有限。 esiRNAs沉淀和TE缓冲液悬浮。收益率是衡量紫外吸收测量和浓度是由溶解在TE缓冲液中的一个适当的音量调整。最终产品的整体质量检查卡尺Labchip分析。 2。选择一个单元格的行和优化筛选转染 esiRNA（使用Eg5积极和海肾荧光素酶作为阴性对照），增加金额在384孔板转染试剂滴定金额，增加细胞孵育48小时。 Eg5是一个kinesin的电机双极纺锤体组装和枯竭所需的蛋白质，导致有丝分裂逮捕。重复此过程中，不同的转染试剂和细胞株。在这里，我们使用以下的标准程序和oligofectamine转染试剂（Invitrogen）的HeLa细胞培养。 选择最佳的转染条件计数转染的细胞有丝分裂逮捕（圆形）与海肾荧光素酶（RLUC）esiRNA转光镜细胞总数与Eg5 esiRNAs。选择RLUC至少毒性和最明显的表型为Eg5的条件。 为优化转染条件的另一种方法涉及一个稳定的细胞系，表达EGFP（或其他合适的报告基因）的控制下构的积极推动者。转染后对EGFP（或其他报告基因）和RLUC（或其他合适的阴性对照esiRNA）的措施击倒如荧光辅助细胞分选（FACS）的疗效和毒性的esiRNA。请确保使用的EGFP esiRNA是完全互补的靶mRNA的。 3。设置主屏幕5,6 优化自动移液工作站（如宝瓶，特餐和WellMate，矩阵）的所有组件使用的移液精度。由于吹打参数变化的解决方案，体积和板型的类型而定，优化，分别为每一步反复。如果可能的话，移液站应放置在层流罩下，以避免污染。所有的组件在使用前应进行消毒，高压灭菌，如果适用或用75％乙醇喷洒。优化洗涤协议，使交叉污染，从好到被排除了。优化自动移液的详细信息，不能给空间约束，主要取决于所使用的移液工作站。如需进一步信息，请参阅制造协议。 384格式的转染细胞Eg5和RLUC esiRNAs使用上述优化的条件。使用Eg5 RLUC esiRNA交替模式，覆盖了整个板块。 孵育48小时后用冷水100％的乙醇修复细胞，补充水分的PBS 15分钟，25分钟PBS中含有1微克/毫升的DAPI和100μg/ ml的RNA酶A（QIAGEN）染色。最后用PBS和存储在4 ° C。 如奥林巴斯ScanR系统的DAPI荧光显微镜测量强度。通过绘制细胞数量的DAPI强度生成直方图和评估，由G1期细胞百分比计算与DNA含量的2N的细胞周期分布; <2N> 4N S期;为G2/M-phase 4N > 4N非整倍体/多倍体。 评估的结果在板的同质性。需要进一步优化，如果效果显着差异，排除位置EFFECTS。使用多孔板时常见的问题是在孵化过程中时间的边缘井增强蒸发。这导致了不同的实验条件，在不同的井，这往往转化为具体影响板位置。出于这个原因，我们建议，离开屏幕边缘井空。为了进一步减少蒸发确保孵化器在高湿度保持。我们还定期聘请障碍，如康宁透气封箱胶带，阻止水分蒸发的蒸发。其他资源位置效应也必须考虑到，如读出系统的技术变化（显微镜，酶标仪等）或液体处理的变化（渐变，不均匀性的解决方案等）。 统计阳性​​和阴性对照之间的差异提供了就业的检测意义的一项措施。一个阴性对照（或背景噪声;模拟控制）之间较大的差异和样品才开始实际筛选确定。统计学意义的一个很好的措施是Z因素。 z因子下列公式计算： ，Z = 1 – （3 SD [样本] + 3 SD [模拟]）*（|音像[示例] – AV [模拟] |）-1;与SD：标准差; AV：平均。 z因子为1> Z> 0.5表示一个阴性对照组显着性的分离，从7阳性对照（和噪声）。 4。主屏幕准备384孔组织培养板转染对利用上述优化条件下的esiRNAs。在这里，我们使用15ng esiRNA每口井在5μLTE缓冲液溶解。每盘至少有8个控制仓位应装有合适的正面和负面的生物研究过程的控制（在这里：Eg5和RLUC）为了避免位置效应边缘井装载与5μLTE缓冲液。 添加5μLOptiMEM0.2μlOligofectamine（Invitrogen公司），其中包含每口井，混合和20分钟在室温下孵育。 添加到转染混合物（在这里：在25个细胞/μL浓度的HeLa细胞悬液40μl;相当于1000个细胞，每孔）的细胞悬液，孵育72小时。 测量DNA含量的自动显微镜（奥林巴斯ScanR，见上文）。评估击中选择使用的Z -得分统计：所有样品为阴性对照作为参考信号esiRNAs计算Z分数。请注意，Z – score模型是不相同的z因子。 Z分数提供了一个统计意义的样本值比较（模拟）控制措施。它是下列公式计算： Z =（值[样本] -平均[模拟]）*标准偏差[模拟] -1。 对于命中选择一个门槛已经得到应用。通常情况下，显着性标准，如：2 <Z <-2被使用，但根据数据集的质量，研究生物过程或简单地在屏幕的范围，可能适用不同的阈值。除了 ​​相当容易的Z – score模型的统计也更复杂的数学计算方法可用于（里面可以发现到广泛的领域筛选数据的统计评价圣马洛等8）。 5。二次屏幕和命中验证一个次要的画面如下，以消除因实验错误或脱靶效应误报的主屏幕。对于选定命中的主屏幕使用相同的程序应反复更大的重复数（3-5），以便更好的统计评价。 对于核实点击次要的非重叠esiRNA对在初始屏幕上确定的目标（或另一种非重叠的沉默触发）应使用。应适用相同的检测和读出主屏幕。 最终选定的基因可以被验证的跨物种的RNAi救援9。从而，一个细菌人工染色体（BAC），如该基因的小鼠同源编码是稳定转染到细胞中。 BAC -构造保存在其基因组范围内的基因，并允许一个近乎生理的表达。对人类内源性基因的RNAi将离开鼠标转基因表达的改变抢救RNAi的表型。 RNAi的救援提供核查提供最新的RNAi表型的金标准。 最后，经审定的候选人更详细的研究，最终推导出机械的理解。在许多情况下，RNA干扰可以使用在这些实验中，例如在次要的，更详细的分析。