포유 동물 세포에서 RNAi 심사를위한 선교 esiRNA
Summary
여기 우리는 세포 분열에 관련된 유전자에 대한 높은 처리량 화면에 인간의 esiRNA 라이브러리를 사용합니다. 우리는 설정하고 esiRNA 화면뿐만 아니라, 어떻게 결과를 분석하고 검증을 실시하는 방법을 보여줍니다.
Abstract
RNA 간섭 (RNAi)는 유전자 발현의 제어를위한 기본적인 세포 메커니즘입니다. RNAi는 작은 방해 RNAS (siRNAs)로 알려진 짧은 두 번 좌초 RNAS에 의해 유발됩니다. 짧은 이중 좌초 RNAS은 주사위 놀이를하는 사람, endonucleases의 RNase III 제품군의 단백질의 활동에 의해 더 이상 두 번 좌초 엽 성의 전구 물질에서 발생한. 결과 조각은 동족의 목표 mRNA에 지시, RNA 유도 입을 복합 (RISC)의 구성 요소입니다. RISC는이를 인코딩 단백질 1,2,3의 표현을 줄이는 목표 mRNA를 클리브스. RNAi는 작은 간섭 RNAS을 이용한 포유 동물 세포에서 유전자 기능 연구의 손실에 대한 강력하고 널리 사용되는 실험 방법이되었다.
현재 두 가지 방법은 작은 간섭 RNAS의 생산에 사용할 수 있습니다. 다른 방법은 체외에서 RNase III에 의해 대상 특정 긴 이중 좌초 RNAS의 endonucleolytic 절단을 고용하고 반면에 한 가지 방법은, 화학 합성을 포함한다. 따라서, siRNA와 같은 oligonucleotides의 다양한 수영장도 endoribonuclease – 준비 siRNA 또는 esiRNA로 알려져있는 생산됩니다. 화학적 파생 siRNAs와 esiRNAs의 효능의 비교 모두 트리거 대상 – 유전자 입을에 관심이있다는 것을 보여줍니다. 특이성을 비교할 때 차이는, 그러나, 볼 수 있습니다. esiRNAs 고유의 복잡한 혼합물이보다 구체적인 최저 10 리드 반면, 대부분 하나의 화학적 합성 siRNAs는 유명한 오프 대상 효과를 생산하고 있습니다.
본 연구에서는, 우리는 게놈 규모 선교 esiRNA 라이브러리와 세포주기의 진행에 관련된 유전자의 식별을위한 DNA – 컨텐츠 화면에 exemplified RNAi 심사에 대한 활용의 디자인을 제시한다. 우리는 transfection 프로토콜 및 높은 처리량의 심사에 대한 분석을 최적화하는 방법을 보여줍니다. 우리는 또한 통계적으로 평가할 수있는 방법을 대규모 데이터 세트 설명하고 기본 공격을 확인하는 방법을 제시한다. 마지막으로, 우리는 검증된 히트 자세한 기능 characterizations에 대한 잠재적인 시작 포인트를 제공합니다.
Protocol
Discussion
RNA 간섭은 손실 기능 phenotypes을 연구하는 표준 기술이되었습니다. RNAi – 중재자의 대규모 컬렉션 서로 다른 공급 업체에서 사용할 수 있으며, 유전자 입을위한 쉽고 비용 효과적이고 신속한 방법을 제공합니다. 이것은 다른 종과 세포 유형의 다양한 범위에 게놈 규모의 관점을 허용 많은 생물 학적 과정에서 키 플레이어 체계적인 심사를 위해 문을 열었습니다.
높은 거짓 긍정과 거짓 부정적인 요금은 RNAi 화면에서 일반 과제입니다. 이 문제를 해결하기 위해 상당한 노력은 효능을 향상시키기 위해 투자하고 특히 입을의 특이성이 트리거되었습니다. 중요한 발견은 동일한 증명서를 대상으로 다양한 siRNAs의 수영장 크게 타겟 특이성을 향상 것이었습니다. 다른 siRNAs 매우 복잡한 수영장이 endoribonuclease에 의해 생산되기 때문에 esiRNAs는 RNAi 화면에서 거짓 긍정적인 속도를 줄이고, 높은 목표 특이성 트리거입니다. esiRNAs도 또한 잘못된 부정적인 속도를 줄이고, 효율적인 knockdowns 달성을 증명하고있다.
RNAi 스크린은 기술적으로 요구되기 때문에, 그들은 가능성이 몇 시간 동안 일상적으로 수행하기 어려운 상태로 유지됩니다. 시약 및 악기 더 많은 실험실들이 전문 지식을 공유 얻을 그러나, 현대 생물학의 RNAi 화면의 사용은 향후 증가할 것으로 간주됩니다.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
우리는 토론을위한 뷰큘츠 실험실과 시그마 – 알드리치 RNAi – 팀 구성원을 인정하고 싶습니다. 우리는 맥스 플랑크 사회와 Bundesministerium FÜR Bildung 놀이 Forschung 그랜즈 [0315105] 지원을위한 이동 – 바이오에게 감사를 표합니다.
선교 ®는 시그마 – 알드리치 생명 공학 LP의 등록 상표입니다
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comments |
| MISSION esiRNA | Sigma-Aldrich | For additional information contact: rnai@sial.com | ||
| Wellmate | ThermoScientific | |||
| Breathable sealing tape | Corning | Breathable Sealing Tape, Sterile (Product #3345) | ||
| OptiMEM | Invitrogen | |||
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | 200 proof (absolute), for molecular biology | |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P5493 | BioReagent, 10x concentrate, suitable for cell culture, for molecular biology | |
| 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride | Sigma-Aldrich | D8417 | Poweder, BioReagent, suitable for cell culture, >98% (HPLC and TLC) | |
| Ribonuclease A from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | R6513 | For molecular biology, ≥70 Kunitz units/mg protein, lyophilized powder | |
| Tris-EDTA buffer solution | Sigma-Aldrich | T9285 | 100 x, for molecular biology |
References
- Ghildiyal, M., Zamore, P. D. Small silencing RNAs: an expanding universe. Nat Rev Genet. 10, 94-108 (2009).
- Jackson, A. L. Expression profiling reveals off-target gene regulation by RNAi. Nat Biotechnol. 21, 635-637 (2003).
- Echeverri, C. J. Minimizing the risk of reporting false positives in large-scale RNAi screens. Nat Methods. 3, 777-779 (2006).
- Henschel, A., Buchholz, F., Habermann, B. DEQOR: a web-based tool for the design and quality control of siRNAs. Nucleic Acids Res. 32, W113-W120 (2004).
- Kittler, R., Pelletier, L., Buchholz, F. Systems biology of mammalian cell division. Cell Cycle. 7, 2123-2128 (2008).
- Kittler, R. Genome-scale RNAi profiling of cell division in human tissue culture cells. Nat Cell Biol. 9, 1401-1412 (2007).
- Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J Biomol Screen. 4, 67-73 (1999).
- Malo, N., Hanley, J. A., Cerquozzi, S., Pelletier, J., Nadon, R. Statistical practice in high-throughput screening data analysis. Nat Biotechnol. 24, 167-175 (2006).
- Kittler, R. RNA interference rescue by bacterial artificial chromosome transgenesis in mammalian tissue culture cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 2396-2401 (2005).
- Kittler, R. Genome-wide resources for endoribonuclease-prepared short interfering RNAs for specific loss-of-function studies. Nat Methods. 4, 337-344 (2007).
