esiRNA بعثة لفحص رني في خلايا الثدييات
Summary
هنا نستخدم مكتبة esiRNA الإنسان في شاشة عالية الإنتاجية للجينات لها دور في انقسام الخلايا. نحن لشرح كيفية إعداد وإجراء شاشات esiRNA ، فضلا عن كيفية تحليل والتحقق من صحة النتائج.
Abstract
تدخل الحمض النووي الريبي (رني) هي الآلية الأساسية الخلوية للتحكم في التعبير الجيني. هي التي يسببها رني الرنا المزدوج تقطعت بهم السبل قصيرة الصغيرة التي تعرف أيضا باسم الرناوات التدخل (siRNAs). على المدى القصير المزدوج تقطعت بهم السبل الرناوات تنشأ من السلائف مزدوجة يعد تقطعت بهم السبل نتيجة نشاط المقامر ، وهو بروتين من عائلة الثالث من ريبونوكلياز endonucleases. الشظايا الناتجة مكونات الحمض النووي الريبي إسكات المعقدة التي يسببها (RISC) وتوجيهه إلى الهدف مرنا وما شابه ذلك. RISC يشق على مرنا الهدف مما يقلل من التعبير عن بروتين ترميز 1،2،3. وقد أصبح وسيلة قوية رني وتستخدم على نطاق واسع تجريبية لفقدان دراسات وظائف الجينات في خلايا الثدييات الصغيرة الاستفادة الرناوات التدخل.
حاليا اثنين من الطرق الرئيسية تتوفر لإنتاج صغيرة الرناوات التدخل. أسلوب واحد يتضمن التركيب الكيميائي ، في حين أن أسلوب بديل توظف الانقسام endonucleolytic محددة الهدف الرنا المزدوج تقطعت بهم السبل منذ فترة طويلة الثالث ريبونوكلياز في المختبر. وبذلك ، يتم إنتاج مجموعة متنوعة من سيرنا مثل [أليغنوكليوتيد] الذي يعرف أيضا باسم endoribonuclease المعدة أو esiRNA سيرنا. مقارنة بين فعالية siRNAs كيمائيه وesiRNAs يظهر أن كلا من مشغلات هي كامنة في إسكات الجينات المستهدفة. ويمكن أن الاختلافات ينبغي ألا ينظر إليه عند مقارنة التحديد. العديد من واحدة تنتج كيميائيا توليفها siRNAs بارزة خارج الهدف آثار ، في حين أن مزيج معقد المتأصلة في esiRNAs يؤدي الى ضربة قاضية أكثر تحديدا 10.
في هذه الدراسة ، فإننا نقدم تصميم الجينوم النطاق المكتبات esiRNA بعثة واستخدامه لفحص رني التي تجسدت شاشة محتوى الحمض النووي لتحديد الجينات المسؤولة عن تقدم دورة الخلية. نعرض كيفية تحسين بروتوكول ترنسفكأيشن والفحص لفرز في إنتاجية عالية. أيضا كيف نبرهن على مجموعات كبيرة من البيانات يمكن تقييمها إحصائيا والحاضر وسائل للتحقق من صحة يضرب الابتدائي. أخيرا ، يمكن أن نعطي نقطة انطلاق لمزيد من التوصيفات الوظيفية الزيارات التحقق من صحتها.
Protocol
Discussion
لقد أصبح التدخل RNA تقنية قياسية لدراسة الخسائر من الظواهر ذات وظيفة. على نطاق واسع ، مجموعات من الوسطاء رني المتوفرة من مختلف الموردين ، وتوفير وسيلة سهلة وفعالة من حيث التكلفة وسريعة لإسكات الجينات. فتح هذا الباب لفحص منتظمة لرئيسى لاعبين في كثير من العمليات البيولوجية السماح منظور الجينوم النطاق بشأن طائفة واسعة من الأنواع المختلفة وأنواع الخلايا.
ارتفاع معدلات سلبية كاذبة وزائفة إيجابية تشكل تحديا مشتركا في شاشات رني. لمعالجة هذه المشكلة ، وقد استثمرت جهودا كبيرة لتحسين كفاءة وعلى وجه الخصوص بتشغيل خصوصية إسكات. كان الاكتشاف المهم أن مجموعة من siRNAs مختلفة تستهدف نص يعزز إلى حد كبير نفس النوعية المستهدفة. لأنه أنتج مجموعة معقدة جدا من siRNAs مختلفة من endoribonuclease ، esiRNAs مرتفعة مشغلات خصوصية المستهدفة ، وتخفيض معدل إيجابية كاذبة في شاشات رني. وقد أثبتت esiRNAs أيضا لتحقيق knockdowns كفاءة ، وخفض أيضا سعر سلبية كاذبة.
لأن الشاشات رني يطالبون من الناحية الفنية ، فإنها من المرجح ان تظل تحديا لأداء على أساس روتيني لبعض الوقت. لكن ، وكما كواشف المختبرات وأدوات الحصول على أفضل وأكثر خبراتهم ، تعتبر استخدام شاشات رني في البيولوجيا الحديثة لزيادة في المستقبل.
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
نود أن نعترف أعضاء المختبر بوتشولز وسيغما الدريخ رني في الفريق للمناقشة. نود أن نشكر جمعية ماكس بلانك والفراء Bundesministerium Bildung اوند الإضافية اطلعوا سباقا الذهاب بيو [0315105] للحصول على الدعم.
بعثة ® هي علامة تجارية مسجلة لشركة التكنولوجيا الحيوية سيغما الدريخ
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comments |
| MISSION esiRNA | Sigma-Aldrich | For additional information contact: rnai@sial.com | ||
| Wellmate | ThermoScientific | |||
| Breathable sealing tape | Corning | Breathable Sealing Tape, Sterile (Product #3345) | ||
| OptiMEM | Invitrogen | |||
| Ethanol | Sigma-Aldrich | E7023 | 200 proof (absolute), for molecular biology | |
| Phosphate buffered saline | Sigma-Aldrich | P5493 | BioReagent, 10x concentrate, suitable for cell culture, for molecular biology | |
| 4′,6-Diamidino-2-phenylindole dihydrochloride | Sigma-Aldrich | D8417 | Poweder, BioReagent, suitable for cell culture, >98% (HPLC and TLC) | |
| Ribonuclease A from bovine pancreas | Sigma-Aldrich | R6513 | For molecular biology, ≥70 Kunitz units/mg protein, lyophilized powder | |
| Tris-EDTA buffer solution | Sigma-Aldrich | T9285 | 100 x, for molecular biology |
References
- Ghildiyal, M., Zamore, P. D. Small silencing RNAs: an expanding universe. Nat Rev Genet. 10, 94-108 (2009).
- Jackson, A. L. Expression profiling reveals off-target gene regulation by RNAi. Nat Biotechnol. 21, 635-637 (2003).
- Echeverri, C. J. Minimizing the risk of reporting false positives in large-scale RNAi screens. Nat Methods. 3, 777-779 (2006).
- Henschel, A., Buchholz, F., Habermann, B. DEQOR: a web-based tool for the design and quality control of siRNAs. Nucleic Acids Res. 32, W113-W120 (2004).
- Kittler, R., Pelletier, L., Buchholz, F. Systems biology of mammalian cell division. Cell Cycle. 7, 2123-2128 (2008).
- Kittler, R. Genome-scale RNAi profiling of cell division in human tissue culture cells. Nat Cell Biol. 9, 1401-1412 (2007).
- Zhang, J. H., Chung, T. D., Oldenburg, K. R. A Simple Statistical Parameter for Use in Evaluation and Validation of High Throughput Screening Assays. J Biomol Screen. 4, 67-73 (1999).
- Malo, N., Hanley, J. A., Cerquozzi, S., Pelletier, J., Nadon, R. Statistical practice in high-throughput screening data analysis. Nat Biotechnol. 24, 167-175 (2006).
- Kittler, R. RNA interference rescue by bacterial artificial chromosome transgenesis in mammalian tissue culture cells. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 2396-2401 (2005).
- Kittler, R. Genome-wide resources for endoribonuclease-prepared short interfering RNAs for specific loss-of-function studies. Nat Methods. 4, 337-344 (2007).
