גל T-Ion Mobility-ספקטרומטריית מסה: הפרוצדורות בסיסי לניתוח חלבונים מורכבים

ההליך אנו מתארים מתמקד אך ורק על ניתוח IM-MS של קומפלקסים חלבונים. לכן, אנו ממליצים החוקרים בקיא בתחום MS מבניים מתייחסים הכנת הצעדים מדגם, כיול המכשיר ו-MS ו-MS במקביל הליכי אופטימיזציה המתואר קירשנבאום et al. Http://www.jove.com/index/details 2009. stp? ID = 1954. באופן כללי, פרוטוקול זה כרוך ריכוזים נמוכים של מיקרו מורכבת (10-20 מיקרומטר) ב חיץ נדיפים כגון אמוניום אצטט (0.005-1 M, pH 6-8). בהתחשב בעובדה 1-2 μl נצרכים לכל nanoflow נימי, אנו מציעים 10-20 μl כמו נפח מינימלי, כדי לאפשר אופטימיזציה של תנאי MS. חלק 1: רכישת ספקטרום יון ניידות ספקטרומטריית מסה הגדר את ספקטרומטר מסה על המצבים הבאים של המבצע: ניידות-TOF, רכישת יון חיובי, ו-V-mode. הפעל את כל הגזים (API, מלכודת ו-IMS). אנו משתמשים N 2 להפרדה IM, ו – אר עבור מלכודת / העברה. הערכים ההתחלתיים אינם מומלצים 1.5 mL / min לאזור מלכודת, ואת זרימת הגז של 24 מ"ל / דקה עבור המכשיר IMS. הגדר את טווח m / z הרכישה. לקבלת מורכבות חלבון ידוע, אנו ממליצים להשתמש הראשונית של מגוון רחב המונית, אשר לאחר מכן ניתן לצמצם את הערכים הרצויים. במקביל, להתאים את פרופיל MS יעילות שידור מקסימלית. עבור קומפלקסים גדולים, טווח המוני הרכישה צריך להיות מוגדר מ 1,000 – 32,000 מ '/ z, ואת פרופיל MS אוטומטית. אחרת, הפרופיל ניתן להגדיר, על פי הטבלה הבאה: מ '/ z לשכון (%) כבש (%) 960 10 20 3200 30 40 10667 בדוק את הגדרת RF, ואם יש צורך, להתאים את הערכים המתאימים קומפלקסים חלבונים גדולים, כך: מקור מלכודת IMS להעביר RF אופסט 450 380 380 380 RF Gain 0 0 0 0 הגבל RF 450 380 380 380 החל מתח נימי (1,050-1,400 V) ולחץ nanoflow נמוכה (0.00-0.03 בר). לאחר הריסוס הוא יזם, מנסה להפחית את הלחץ nanoflow ערך מינימלית. בנוסף, להתאים את המיקום של נימי, ביחס חרוט. כוונו את הפרמטרים רכישת MS, לרכוש ספקטרום היטב לפתור MS: שיפוע הלחץ לאורך המכשיר, ואת חרוט דגימה וכן חרוט החילוץ, הטיה מלכודת והעברת ההגדרות פוטנציאל, צריכים להיות מותאם (המפורטים הקשורים יופיטר פרוטוקול קירשנבאום et al. http://www.jove.com/index/details.stp?ID=1954 2009). אף על פי הפרמטרים האלה הם מדגם תלויי, התנאים השתמשנו לרכישת ספקטרום MS של ההמונים יונים שונים, החל פפטיד קומפלקסים חלבונים, המפורטות בטבלה 1, (ראה גם איור. 1). כדי למזער את הפעלת לנסות את מורכבות להפחית בהדרגה (בקפיצות של ~ 10 V) מתחי את הגביע המדגם, מלכודת ועל משוא פנים מבלי לשנות את מיקום השיא. לאחר הקשת מסה האופטימלי מתקבל פרופיל הזמן להיסחף צריך להיות מותאם. כאשר מנתחים אסיפות חלבון, תנאים אופטימליים המונית והן מדידות ניידות הם לעתים קרובות לא תואם, ולכן חשוב למצוא את האיזון הנכון בין השניים. בסך הכל, העלילה ניידות יון צריך להיות מותאם כך הפסגות מופצים על מגוון להיסחף כל הזמן, את הפרופיל שיא חלקה, מתקרב הפצה גאוס (איור 2A, 2B). שיא אסימטריה משמעותית יכולה להיות קשורה הפרדה לקויה של תצורות מרובות. ככלל, שלושת הפרמטרים, T-מהירות הגל, T-גל גובה זרימת IMS שיעור הגז יכול להיות מכוון כדי לייעל את ההפרדה ניידות. הגדלת מהירות T-גל יגדיל את הזמן להיסחף פרופיל הפצה, תוך עלייה T-גל ערכי גובה תצמצם אותו. באופן דומה, להגדיל את זרימת הגז IMS יעבור את הפרופיל הזמן להיסחף לכיוון ערכים גבוהים יותר (זרימת גז מינימלית IMS צריך להיות 10 mL / min). אנו ממליצים להשאיר שניים משלושת המשתנים זמין קבועה, ואופטימיזציה השלישי עד הספקטרום IM היטב נפתר (איור 2B). לשם כך, קבע את מהירות T-גל ואת זרימת הגז 250 m / s ו – 24 mL / min, מחדשspectively. ואז, כנקודת מוצא, לקבוע את גובה T-V גל ו 3, באופן הדרגתי, להגדיל אותו ב 1 במרווחים V. באופן כללי, יונים גדול ידרוש גובה הגלים גבוהים יותר. בדרך כלל, אין צורך לשנות את הלחץ IMS, עם זאת, מתח גבוה, כאשר ההטיה נדרשים עבור כוונון, הפחתת גז IMS תאפשר ירידה בשווי מתח הטיה, וכתוצאה מכך צמצום הפעלת חלבון מורכב. בסך הכל, ברזולוציה מקסימלית של 10-12 t / Δt ניתן להגיע. כאשר התנאים לא מותאמים (גובה נמוך T-גל או מהירות גבוהה T-גל ו / או בלחץ גבוה IM), היונים לא לעבור דרך המכשיר IM ביעילות, והמסע שלהם עלול לקחת זמן רב יותר מאשר הזמן הדרוש יון הבא מנות להשתחרר לתוך התא ניידות. כתוצאה מכך, מנות יון חדש ישוחררו מאזור מלכודת לפני המנה הקודמת נמסרה באזור הסמים. זה יוביל לאפקט 'רול מעל ", שבו שיא נצפו בחלק הראשון של הספקטרום הזמן להיסחף זהה לזה של יונים בקצה עוקב (איור 2C). ממצא זה ניתן למנוע על ידי הגדלת גובה T-גל, ולהפחית טי גל מהירות ולחץ IMS. בנוסף, הזמן לשחרר מלכודת יכול להיות מותאם. יתר על כן, חשוב לוודא כי גובה T-גל העברת מוגדר לפחות 5 V. כדי למנוע דליפה של יוני כלפי התא IMS, אנו ממליצים כי גובה מלכודת ניידות להישמר ברמות היותר (30 V). מהירות נמוכה משרעת גבוהה של העברת T-גלי עלול להוביל את "גלי" של הפרופיל זמן הפצה להיסחף (איור 2 ד). ממצא זה מתרחש כאשר ההפרדה ניידות של יונים (יון זמן ההגעה / להיסחף) לא נשמר באמצעות העברת ואזורים תוף, בגלל הסנכרון בין חלקי התדר דחפן ואת מהירות העברת גל טי. כדי לחסל את האפקט הזה, או את הזמן או דוחף את מהירות העברת גל T-צריך להיות מותאם. מאז תדירות דחפן קשורה בטווח המוני, ממצא זה עשוי להופיע שוב כאשר פרמטר זה השתנה. T-גל גובה מפעיל השפעה משנית, אם כי הפחתה שלה עשוי גם לעזור לחסל את האדוות. לאחר הפרמטרים הנ"ל מותאמים, IM-MS הנתונים ניתן לרכוש. חלק 2: הקרנת תנאי הניסוי כדי להבטיח ניידות מדידות של מבנים מקומיים כדי להשיג פתרון מאוד פסגות MS, קומפלקסים חלבונים מופעלים לעתים קרובות בתוך ספקטרומטר מסה, כדי לקדם את הפשטת מים שיורית ורכיבים חיץ 11. עם זאת, אם את אנרגיית הפעלה מוגברת מעבר לערך סף, חלקי התגלגלות יכול להיגרם להרכיב מדינות ביניים מספר 12, אשר צפויים להתאים את מבנה יליד פתרון של מדינה, (איור 3A-C). כתוצאה מכך, שיא הזמן להיסחף יכול להיות מוזז והרחיב, המשקף את האוכלוסייה הטרוגנית של פרש מבנים. על מנת לקבל זמן להיסחף נתונים בקנה אחד עם פתרון שלב מבנים, חיוני בזהירות לשלוט במתחים המשמשים מאיץ יונים, לפני ההפרדה IM. יתר על כן, עבור MS רזולוציה גבוהה עדיף להגדיל את העברה ולא מתח מלכודת. כאשר המכשיר ממוקם IM, הראשון, ואחריו האזור העברת מנתח TOF, ומכאן, הפעלת כדלקמן המדידה צ'אט יונים נותר ללא פגע, ואילו דיוק MS יכול להיות מוגברת. כדי לאמת כי רכישת נתונים מתבצעת בתנאים לשמור על מבנה הילידים של המתחם, מומלץ כי הנתונים שיירשמו על פני טווח של תנאי הניסוי פתרון, ולא על פי אחד, ערכה אופטימיזציה של פרמטרים: הגדלת מתח נימי קונוס באופן הדרגתי, תוך מעקב אחר ההשפעה על הספקטרום הזמן להיסחף. כמו שלב 1, להגביר את המתח התנגשות מלכודת באופן הדרגתי, ולרכוש נתונים על 10 מרווחי V. כדי לזהות את תצורות פרש ולהעריך את הנתונים רכשה, באופן ידני לגרום דיסוציאציה של הקומפלקס חלבון ידי titrating המדגם עם חומצה אצטית על פני טווח ה-pH של 2-7, ולהקליט את הנתונים (איור 3B). חלק 3: בדיקת ההתאמה בין ערכי הזמן להיסחף חתך אזורי בניגוד למדידות IM הקונבנציונלית, שבה הזמן נמדד בערכים להיסחף קשורים באופן ליניארי על Ω, במערכת IMS T-גל, באזור החתך לחצות מוגדר על ידי גישה כיול. כך, במקום מדידה מוחלטת, מתאם מעריכי היחסי שנוצר בין הזמנים להיסחף נמדד Ω 1,13: כאשר t D זה הזמן להיסחף נמדדת, ו-X הוא קבוע פרופורציה כי ניתן להפיק עקומת כיול. כיול היא לבצעעורך ידי מדידת הזמנים סחיפה של יונים עם Ω ידוע (נמדד מניסויים IM קונבנציונלי). זמן המדידות מכוילים הסחף באמצעות מפוגל חלבונים סוסים ציטוכרום C, לב מיוגלובין סוס שור היוביקוויטין ידוע התנגשות עם חתכים. לשם כך, פתרונות של 10 מיקרומטר 49/49/2, יחס נפח, מים / מתנול / חומצה אצטית צריכים להיות מוכנים (ריאגנטים בשימוש המפורטות טבלה 3). IM-MS רוכשת את הנתונים עבור חלבונים calibrant תחת בדיוק את התנאים מכשיר אותו לשמש חלבון מטרה או חלבון מורכב: (חלק 1). כל המתחים ואת הערכים הלחץ צריך להיות זהה, כדי לשמר את ההגדרות ההפרדה IM. עבור כל מדינה אחראית על החלבונים calibrant לחלץ את להיסחף ניסיוני זמן ערך (t ד) (המתואר בפרק 4). נכון בכל הפעמים להיסחף calibrant (t ד) (טבלה 2) באמצעות המשוואה הבאה: , כאשר m / z הוא היחס בין מסת אל הממונה על יון ציין, ו-c היא עומס עבודה משופרת (EDC) מקדם עיכוב 1. הערך שלה, בדרך כלל בין 1.4 ו – 1.6, הוא מכשיר תלויי. ערך EDC מצוין בתוך מערכת | הגדרות רכישה | הגדרת הכרטיסייה רכישה. באמצעות חתך של פרופ 'דוד Clemmer מסד נתונים: http://www.indiana.edu/ ~ clemmer / מחקר / לחצות 20section%% 20database/Proteins/protein_cs.htm 14 לתקן כל אחד calibrant חתך למדינה הן תשלום יונים מסה מופחתת. שם Ω C הוא תיקן חתך, Ω הוא ספרות חתך, z היא המדינה הממונה יון, m הוא משקל מולקולרי של יון calibrant, G ו-M הוא המשקל מולקולרי של הגז רקע IM (בדרך כלל N 2). העלילה (t ד ') נגד ב (Ω ג) (איור 4 א). עקומת כתוצאה המתאים המשוואה הבאה: X הפרמטרים ניתן לחלץ באמצעות הולם את העלילה יחסים ליניארי. X שיפוע מתאים גורם פרופורציה מעריכי ו מייצג את בכושר-נחוש מתמיד. חשב את מקדם המתאם מתאים r 2, באמצעות המשוואה של פירסון: . ערכים מקובלים עבור R 2 הם יותר מ 0.95 (איור 4 ב). מקדם קורלציה נמוכה ערך יכול להיות בגלל: הושלמה התגלגלות של calibrants חלבון. זה יוביל שיא הרחבת בשל הרכבה ביניים הטרוגנית של מצבים. מניסיוננו, מדגם בגילאי יכול להתדרדר את הספקטרום IM. תנאים ניסויים שונים המשמשים את החלבונים calibrant שונים. במקרה זה, זוממים את הנתונים עבור כל חלבון בנפרד צריך ליצור מקדמי המתאם מגוונות, אם כי כל אחד מהם צריך להיות גבוה מ 0.95. נתונים רועש שגוי החלקה מרכוז של חלוקת הזמן להיסחף. חישוב השגיאה. Recorrect הזמן להיסחף calibrant באמצעות גורם מעריכי נקבע, X, נגזר בשלב 7: כצעד אימות, replot Ω C לעומת ולהגדיר את מקדם המתאם. ערכים גבוהים יותר מאשר 0.95 יש לצפות. על פי הנוהל המתואר בשלב 4, לתקן את הזמן להיסחף מדודה של חלבון המטרה או חלבון מורכב: כיול הזמן להיסחף של המתחם יעד חלבון / חלבון באמצעות גורם מעריכי, X, המוגדר שלב 7: חישוב Ω של המתחם יעד חלבון / חלבון באמצעות התאמה שנקבע קבוע, מוגדר שלב 7: . עבור כל תנאי הניסוי, שלבים 2-13 יש לחזור. כאשר הגדרת שטח חתך רוחב של חלבון לא ידוע או מורכב חלבון, אנו ממליצים כי כל הניסוי יש לחזור לפחות שלוש פעמים, ואת סטיית התקן של מדידות אלה נקבע בשלושה עותקים. חלק 4: הגדרת זמן ערכים להיסחף תוכנה דרושה: MassLynx ו Driftscope (ווטרס). פתח את ספקטרום IM-MS באמצעות תוכנת Driftscope. מתוך התפריט הראשי, בחר ויEW ו Chromatogram בטל, זמן הסחף ואת ספקטרום (אופציונלי), עוזב פעיל רק את המפה 2D הצגת הזמן להיסחף לעומת m / z. מתוך שורת התפריטים, לבחור תצוגה | אפשרויות | לוח תצוגה עורך ולהתאים את ערכי סף עוצמה כדי למזער את רעש הרקע (ברוב המקרים, הגדרה זו יכולה להיות מוגדרת כ 30-40% = מינימום ומקס 100 = ספירת%). בחר תצוגה | סולם 2D אינטנסיביות מפה, ואת שלוש אפשרויות יופיעו: קנה המידה הלינארי, התחבר קנה מידה סולם השורש הריבועי. הבחירה של סולם התחבר (נתונים לוגריתמי לשנות) יהיה לדחוס את קוד צבע אינטנסיביות, ולאפשר את המראה בו זמנית של מגוון רחב של עוצמות (להבדיל האפשרויות שורש ליניארי רבועים, עם אשר רק הפסגות אינטנסיבית ביותר יהיה נראה לעין) . מלוח סרגל כלים, שימוש בכלי כפתור בחירה. אפשרות זו תפעיל את אפשרויות בחירה שונות, לאפשר בחירה של האזור הרלוונטי בתוך הספקטרום. הכלי המדויק ביותר הוא הפיכת אזור של בחירות ריבית, שבאמצעותו גבול עלול להיגרר סביב האזור של עניין, ובכך להוציא את כל הנתונים מיותר פסגות רעש. כמו כן, אפשרויות בחירה אורתוגונלית ו – בנד שימושיים, כאשר אזור של אינטרס אינו מוקף בפסגות מיותר. לאחר באזור של עניין נבחרה, השתמש קבל פקודה הנבחר הנוכחי כדי להסיר מידע מיותר. לייצא את הנתונים MassLynx, תוך שמירה על מידע זמן להיסחף. בתוך MassLynx, פתח את chromatogram של הספקטרום נשמר זמן להיסחף, ולשלב פחי זמן. הספקטרום המונית המקביל ייפתח באופן אוטומטי. החל מנקה את הפונקציה על ידי הגדרת גודל החלון ומספר פרמטרים חלקה (צריך להיות מכוון במיוחד עבור כל קשת, באמצעות ערכי מינימלי). החל המחקר חיסור, במידת הצורך. במרכז הקשת ו למדוד את המסה, כדי לאמת את זהות החלבון ואת הדיוק המונית. עבור כל מדינה אחראי, לשלב את מגוון m / z. הספקטרום המקביל זמן להיסחף יופיעו באופן אוטומטי. חלקה במרכז זמן פרופיל להיסחף, ולהגדיר את ערך הזמן להיסחף על ידי המציין את centroid שיא של כל אחד. חלק 5: תוצאות נציג באיור 1. ייצוג סכמטי של המכשיר Synapt HDMS המציין את הפרמטרים העיקריים של הרכישה מתכונן IMS-MS. פרמטרים ניסיוני המשמש IM-MS מדידות מסומנים בהתאם למיקום שלהם בתוך המכשיר. אלומת יונים היא בצבע אדום, ואת הלחץ בכל אזור המיועד בעזרת קוד צבע. הפאנל בתחתית ממחיש את הפוטנציאל שיפוע לאורך המכשיר ואת ההבדלים פוטנציאל להגדיר את מלכודת התנגשות העברת אנרגיות, כמו גם את הפוטנציאל הטיה. כל פוטנציאלים לקריאה הגב מפנה למתח קיזוז סטטי אשר מוגדר בדרך כלל 120V. איור 2. הגעת ניידות יון זמן הפצות לחלבון Gβυ. א מהירות גבוהה T-מוביל גל הפצה צר של הפרופיל הזמן להיסחף. העלילה מתאר את זמן ההגעה ההפצה של 16 + (אדום), 15 + (ירוק), 14 + (כחול), ו – 13 + (מג'נטה) קובע תשלום, כמו גם את הפרופיל הזמן הכולל סחיפה (בשחור) של חלבון G βυ. ב להיסחף אופטימיזציה זמן ספקטרום עם צורה גאוס חלקה שיא. צבע תוויות דומות כמו. ג 'רול על "אפקט, אשר מתרחשת כאשר הפעם נלקח יונים לעבור את התא הניידות היא איטית יותר מאשר המרווח בין הזרקות של מנות חדשות יון לתוך המכשיר. כתוצאה מכך, השיא המורחבת זמן להיסחף מופיע בתחילת הספקטרום. אפקט זה ניתן למנוע על ידי הגדלת גובה T-גל, ולהפחית טי גל מהירות ולחץ IMS. "אדוות" ד מלאכותית נגרמות כאשר גל ה-T העברת מהירות ותדירות דחפן מסונכרנים באופן חלקי. השפעה זו ניתן להתגבר על ידי התאמת או תדירות דחפן או טי גל מהירות העברה. איור 3. ההשפעה של הפעלת יון ותנאי denaturing חלקית על ספקטרום IM-MS של המוגלובין. מגרש הזמן להיסחף לעומת m / z עבור המתחם המוגלובין tetrameric, באמצעות בתמיסה מימית של 10 mM אמוניום אצטט (pH = 7.6) (A, C) ועל תוספת של חומצה אצטית 0.1% (B). נתונים רכשה באמצעות התנגשות מלכודת אנרגיה מתח של 13 V (A, B) ו – 35 וולט (ג) על אף בכל שלושת הפאנלים ספקטרום המונית (מוקרן על החלק העליון) נראה דומה, עם סדרה תשלום tetrameric מרוכז ב 4000 מ '/ z, הזמן להיסחף פרופיל (מוקרן על שני הצדדים) שונה (חלוקת סך הזמן להיסחף הואבשחור, פרופיל 16 + הוא בצבע אדום). בפעם להיסחף יותר של המדגם מפוגל חלקית, שהושגו B, הגז שלב יונים מופעל, שהושג ב-C, מעיד על מידה מסוימת של התגלגלות. תצפית זו ממחישה כי למרות המוני נמדד מתאים מורכב שלם, מבנה הפתרון שלה מופרת. כתוצאה מכך, בקרה קפדנית של תנאי הניסוי הנדרש. איור 4. על ידי יצירת עקומת כיול, מדידות להיסחף זמן ההתנגשות בחתכים יכול להיות מתואמים. א נמדד הזמן להיסחף הערכים של מדינות תשלום מרובות של סוסים ציטוכרום C (עיגולים), הלב סוס מיוגלובין (משולשים) ו שור היוביקוויטין (ריבועים) היו זממו נגד ערכי הספרות Ω תיקנה המדינה הן יון תשלום מסה מופחתת. מתאים התשואות פונקציה לינארית המתאים: ln (Ω C) = Xln (t ד ') + A. גורם מעריכי נקבע (X), מתאים שנקבע קבוע (א), מקדם המתאם מוצגים על המגרש שנרכש עבור נתונים במהירות T-גל של 350 m / s, וגובה הגלים סטטי של 11 ו-B. היסטוגרמה של הפצות מקדם המתאם המתקבל 10 ניסויים כיול רצופים. חלבון מדגם / פרמטרים טכניים GluFibrino- פפטיד מונומר 1.6 kDa מיוגלובין מונומר 17 kDa המוגלובין tetramer 67 kDa Transferrin מונומר 80 kDa GroEL 14-mer 801 kDa לחץ גיבוי, mbar 4.4 5.0 5.1 5.1 6.5 לחץ מלכודת, mbar 1.6×10 -2 2.4×10 -2 2.4×10 -2 2.6×10 -2 2.8×10 -2 לחץ IMS, mbar 4.4×10 -1 4.4×10 -1 4.4×10 -1 4.4×10 -1 4.2×10 -1 קונוס מתח דגימה, V 46 80 80 80 118 הפקת מתח חרוט, V 1.7 1 1 1 3 הטיה מתח, V 20 20 25 25 50 התנגשות אנרגיה מלכודת, V 20 15 15 15 80 התנגשות העברת אנרגיה, V 5 12 12 12 15 טבלה 1. תנאי הניסוי בשימוש לניתוח מקרומולקולות. תקן חלבון Mass מולקולרית (מ) חיובים (z) מ '/ z התנגשות חתך (ב 2) ציטוכרום C 12213 10 1222.3 2226 11 1111.3 2303 12 1018.8 2335 13 940.5 2391 14 873.4 2473 15 815.2 2579 16 764.3 2679 17 719.4 2723 18 679.5 2766 מיוגלובין 16952 11 1542.1 2942 12 1413.7 3044 13 1305.0 3136 14 1211.9 3143 15 1131.1 3230 16 1060.5 3313 17 998.2 3384 18 942.8 3489 19 893.2 3570 20 848.6 3682 21 808.2 3792 22 771.6 3815 היוביקוויטין 8565 8 1071.6 1442 8 1071.6 1622 9 952.7 1649 10 857.5 1732 11 779.6 1802 טבלה 2. חלבונים Calibrant ולחצות התנגשות הערכים שלהם הסעיפים נקבע על ידי קונבנציונאלי measurments IMS 14. התקנים חברה מספר קטלוגי Synapt HDMS-32K RF גנרטור ווטרס בע"מ P-97-Flaming בראון micropipette חולץ סאטר מכשירים P-97 גמגום coater מיקרוסקופית אלקטרונים למדעים EMS550 המשקפת מיקרוסקופ ניקון ריאגנטים חברה מספר קטלוגי אמוניום אצטט סיגמא אולדריץ סיגמא, A2706 CSI 99.999% סיגמא אולדריץ אולדריץ', 203033 מתנול סיגמא אולדריץ Fluka, 34966 חומצה אצטית פישר סיינטיפיק AC12404 סוסים מיוגלובין (מהלב סוס) סיגמא אולדריץ M1882 סוסים ציטוכרום C (מהלב סוס) סיגמא אולדריץ C-2506 שור היוביקוויטין (מתאי דם אדומים) סיגמא אולדריץ U6253 המוגלובין סיגמא אולדריץ H2625 גז תגובות חנקן, 99.999% טהור 8 מטר מעוקב גליל ארגון, 99.999% טהור 8.8 מעוקב meterscylinder לוח 3. ריאגנטים וציוד.