아밀로이드 β 단백질, 알츠하이머 병의 원인이되는 에이전트에 대한 Aptamers의 선택
Summary
Aptamers는가 선택한 짧은 ribo-/deoxyribo-oligonucleotides 아르<em> 체외 수정</em> 특정 대상에 대한 친화력을 바탕으로 진화 방법. Aptamers는 다양한 치료, 진단 및 연구 애플 리케이션과 분자 인식 도구입니다. 우리는 아밀로이드 β 단백질, 알츠하이머 질병의 원인이되는 에이전트 aptamers의 선정 방법을 보여줍니다.
Abstract
알츠하이머 병 (AD 1)의 presymptomatic 진단이 어려운 렌더링 교활한 코스와 진보, 나이 의존, neurodegenerative 무질서이다. 확실히 AD 진단 따라서 광고의 presymptomatic, 조기 진단이 효과적인 치료법 2,3를 개발하고 관리를 위해 중요합니다 수립, 오직 사후 이루어진다.
아밀로이드 β – 단백질 (Aβ) 광고 pathogenesis의 중심이다. 가용성, oligomeric Aβ 어셈블리는 AD 4,5에서 neurotoxicity 기본 시냅스 기능 장애 및 신경 세포 손실에 영향을 믿고 있습니다. 수용성 Aβ 어셈블리 다양한 형태의이 설명되었습니다, 그러나, 그들의 상호 관계 및 광고의 병인 및 pathogenesis 관련성 복잡하고 잘 이해 6되지 않습니다. 특정 분자 인식 도구는 Aβ 어셈블리 사이의 관계를 해명하고 증상이 등장하기 전에 초기 질병 과정에서 이러한 어셈블리의 탐지 및 특성을 촉진 수도 있습니다. 분자 인식은 일반적으로 항체에 의존합니다. 그러나, 분자 인식 도구, aptamers의 대체 수업은 항체 7,8에 비해 중요한 이점을 제공합니다. 지수 농축 (SELEX) 9,10하여 리간드의 체계적 발전 : Aptamers는 체외 수정이 선택에 의해 생성 oligonucleotides 있습니다. SELEX는 다원 진화와 마찬가지로, 수, 그 반복 과정을 선택, 증폭, 강화, 그리고 재산의 영구화, 예를 들어, 아비드, 특정 리간드 바인딩 (aptamers) 또는 촉매 활동 (ribozymes 및 DNAzymes).
현대 생물 공학 및 의학 11 도구로 aptamers의 출현에도 불구하고, 그들은 아밀로이드 분야에서 underutilized되었습니다. 몇 RNA 또는 ssDNA의 aptamers은 프리온 단백질 (PrP) 12-16의 다양한 형태에 대한 선택되었습니다. 재조합 보빈 PrP에 대해 생성되는 RNA aptamer는 아밀로이드 원섬유 18 양식 전체 길이 PrP의 가용성, oligomeric, β – 시트 풍부한 conformational 변형, 보빈 PrP – β 17 인식 표시되었다. Aptamers 2 – microglobulin (β 2m)는 β 2m 원섬유 19 이외의 다른 특정 amyloidogenic 단백질 원섬유를 바인딩하는 찾았습니다 원섬유의의 β의 monomeric 여러 양식을 사용하여 생성되었습니다. Ylera 외. 고정 monomeric Aβ40 20에 대한 선택의 RNA aptamers를 설명했다. 예기치이 aptamers은 원섬유의 Aβ40을 바운드. 모두,이 데이터는 몇 가지 중요한 질문을 올립니다. 왜 monomeric 단백질에 대한 선택 aptamers는 고분자 형태를 인식나요? amyloidogenic 단백질의 monomeric 및 / 또는 oligomeric 형태에 대한 aptamers를 얻을 수 있을까요? 이러한 질문을 해결하기 위해, 우리는 사진을 유발 가교 수정되지 않은 단백질 (PICUP) 22,23을 사용하여 생성된 covalently – 안정 oligomeric Aβ40 21 aptamers를 선택하려했습니다. 이전 결과 17,19,20 마찬가지로, 이러한 aptamers 가능성이 높습니다 aptatope 21 구조 잠재적으로 일반적인 아밀로이드를 인식 Aβ와 기타 여러가지 amyloidogenic 단백질의 원섬유과 반응. 여기, 우리는 이러한 aptamers 21 생산에 사용 SELEX 방법론을 제시한다.
Protocol
1 부 : 단백질 준비와 교차 연결 처음 SELEX에 사용되는 단백질이로 이전 23 설명한 균질, 집계없는 준비를 얻기 위해 1,1,1,3,3,3 – hexafluoro – 2 – 프로파놀 (HFIP)와 pretreated 있습니다. 이 단계는 미리 형성 합산은 가난한 실험 재현성 24 결과 amyloidogenic 단백질의 신속한 집계를 유발하기 때문에 필요하며, 단백질의 unaggregated 아닌 원섬유의 형태 aptamers의 선택을 위해 바?…
Discussion
SELEX 과정의 출발점은 일반적으로 10 12 -10 15 시퀀스를 포함하는 임의의 oligonucleotide 라이브러리의 합성이다. RNA SELEX에서, 여기를 시연 반면 DNA SELEX,이 라이브러리가, ssDNA 수영장이 생성된 후 직접 사용, ssDNA 라이브러리는 체외 수정의 전사에 의해 효소 RNA 수영장 최초로 변환됩니다. 각각의 사이클은 노출과 의도한 대상으로 oligonucleotides의 바인딩을 구성되어 의하여 다음, S…
Disclosures
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
이 작품은 보건의 캘리포니아학과에서 NIH / NIA와 07-65798에서 부여 AG030709 지원했다. 우리는 펩타이드의 합성과 아미노산 분석, 도움 및 프로젝트 지원 및 시약을 제공하는 박사 치 – 홍콩 B. 첸의 초기 단계를 지원하는 박사 엘리자베스 F. 네펠드, 박사 앤드류 D에 대한 마가렛 M. 콘드론을 인정 도움이 토론을 위해. 엘링턴.
Materials
| Material Name | Type | Company | Catalogue Number | Comment |
|---|---|---|---|---|
| Aβ40 | UCLA Biopolymers Laboratory | Lyophilized powder | ||
| MX5 Automated-S Microbalance | Mettler Toledo | |||
| Silicon-coated, 1.6-ml tubes | Denville Scientific | C19033 or C19035 | ||
| 1,1,1,3,3,3-hexafluoro-2-propanol (HFIP) | TCI America | H0424 | Use in a fume hood. | |
| Ammonium persulfate | Sigma | A-7460 | Vortex until the solution is clear. APS is prepared freshly each time and should be used within 48 h. | |
| Tris(2,2-bipridyl)dichlororuthenium(II) hexahydrate | Sigma | 224758-1G | Vortex until the solution is clear. Cover the RuBpy tube with foil to protect the reagent from ambient light. RuBpy is prepared freshly each time and should be used within 48 h. | |
| Dithiothreitol (DTT) | Sigma | 43815 | ||
| D-Salt™ Excellulose™ desalting columns | Thermo Scientific | 20449 | ||
| Ammonium acetate | Fisher Scientific | A637-500 | ||
| Silicon-coated, 0.6-ml tubes | Denville Scientific | C19063 | ||
| Novex Tricine Gels (10–20%) | Invitrogen | EC6625B0X | 10-well; mini size (8 cm X 8 cm); 25 μl loading volume per well; separation range 5 kDa to 40 kDa | |
| Quartz cuvette | Hellma | 105.250-QS | ||
| Beckman DU 640 spectrophotometer | Beckman | |||
| ssDNA library | Integrated DNA Technologies | Custom-ordered | The library was designed to contain 49 random nucleotides flanked by two constant regions containing primer-binding and cloning sites: 5′-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA ATT CCG CGT GTG C (N:25:25:25:25%) (N)49 G TCC GTT CGG GAT CCT C-3′ | |
| Taq DNA polymerase | USB Corporation | 71160 | Recombinant Thermus aquaticus DNA Polymerase supplied with 10× PCR Buffer and a separate tube of 25 mM MgCl2 for routine PCR. | |
| PCR Nucleotide Mix, 10 mM solution | USB Corporation | 77212 | (10 mM each dATP, dCTP, dGTP, dTTP) | |
| Forward primer | Integrated DNA Technologies | Custom-ordered | 5′-TAA TAC GAC TCA CTA TAG GGA ATT CCG CGT GTG C-3′ | |
| Reverse primer | Integrated DNA Technologies | Custom-ordered | 5′-GAG GAT CCC GAA CGG AC-3′ | |
| Thermal cycler | Denville Scientific | Techne TC-312 | ||
| QIAquick PCR Purification Kit (50) | QIAGEN | 28104 | ||
| Agarose | Denville Scientific | CA3510-8 | ||
| Conical, sterile 1.6-ml tubes with caps attached with O-rings | Denville Scientific | C19040-S | ||
| RiboMAX™ Large Scale RNA Production System–T7 | Promega | P1300 | The kit contains: 120 μl Enzyme Mix (RNA polymerase, recombinant RNasin® ribonuclease inhibitor and recombinant inorganic pyrophosphatase); 240 μl transcription 5 buffer; 100 μl each of 4 rNTPs, 100 mM; 110 U RQ1 RNase-free DNase, 1 U/μl; 10 μl linear control DNA, 1 mg/ml; 1 ml 3M sodium acetate (pH 5.2); 1.25 ml nuclease-Free water | |
| α-32P-cytidine 5′-triphosphate, 250 μCi (9.25 MBq), | Perkin Elmer | BLU008H250UC | Specific Activity: 3000 Ci (111 TBq)/mmol, 50 mM Tricine (pH 7.6) | |
| Citrate-saturated phenol:chloroform:isoamyl alcohol (125:24:1, pH 4.7) | Sigma (Fluka) | 77619 | ||
| Chloroform:Isoamyl alcohol (24:1) | Sigma | C0549 | ||
| Absolute ethanol for molecular biology | Sigma | E7023 | ||
| Z216-MK refrigerated microcentrifuge | Denville Scientific | C0216-MK | ||
| illustra ProbeQuant™ G-50 Micro Columns | GE Healthcare | Obtained from Fisher Scientific (45-001-487) | Prepacked with Sephadex™ G-50 DNA Grade and pre-equilibrated in STE buffer containing 0.15% Kathon as Biocide | |
| Triathler Bench-top Scintillation counter | Hidex Oy, Turku, Finland | Triathler LSC Model: 425-034 | ||
| Novex® TBE-Urea Sample Buffer (2×) | Invitrogen | LC6876 | ||
| 6% TBE-Urea Gels 1.0 mm, 10 wells | Invitrogen | EC6865BOX | ||
| Novex® TBE Running Buffer (5×) | Invitrogen | LC6675 | ||
| Radioactivity decontaminant | Fisher Scientific | 04-355-67 | ||
| Gel-loading tips | Denville Scientific | P3080 | ||
| XCell SureLock Mini-Cell | Invitrogen | EI0001 | XCell SureLock Mini-Cell | |
| Autoradiography film | Denville Scientific | E3018 | Use in complete darkness | |
| Autoradiography film, Hyperfilm™ ECL | Amersham Biosciences | RPN3114K | Can be used under red safe light. | |
| Membrane discs | Millipore | GSWP02500 | Mixed cellulose ester, hydrophilic, 0.22-μm disc membranes | |
| Fritted glass support base for 125-ml flask | VWR | 26316-696 | ||
| Petri dishes | Fisher Scientific | 08-757-11YZ | ||
| Urea | Fisher Scientific | AC32738-0050 | ||
| EDTA | Fisher Scientific | 118430010 | ||
| Glycogen | Sigma | G1767 | ||
| 2-Propanol for molecular biology | Sigma | I9516 | ||
| Recombinant RNase inhibitor | USB Corporation | 71571 | ||
| ImProm-II™Reverse Transcription System | Promega | A3802 | ||
| Recombinant RNase inhibitor | USB Corporation | 71571 | ||
| RapidRun™ Loading Dye | USB Corporation | 77524 |
References
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Cite This Article
Rahimi, F., Bitan, G. Selection of Aptamers for Amyloid β-Protein, the Causative Agent of Alzheimer's Disease. J. Vis. Exp. (39), e1955, doi:10.3791/1955 (2010).