Bakteriyel Hücre Elektron Cryotomography

Bakteriyel Hücre Kültürü I. Hazırlık Bir kaç ml sıvı kültürü istenen faz bakteri hücrelerinin, normal medya büyütün. Yüksek konsantrasyon gerekli ise, iplik ve taze medya yeniden askıya alınması kabul edilebilir, ancak bazen bu süreç, hücrelerin yapısal değişiklikler getirmektedir farkında. Işık mikroskobu kültür bulaşanların ve uygun bir izdiham emin olmak için kontrol edin. Bazı bakteri hücrelerinin sopa ya da EM ızgaraları büyüyebilir. Izgaraları, bir karbon tabakası ile altın ızgaralar üzerinde büyüyen hücreleri en sık hücrelere toksisitesini önlemek için kullanılır. Onlar, UV ışığı altında 15 dakika sterilize, 2 dakika için taburcu parlaklık ve sıvı kültürü doğrudan yerleştirilir. Yapışık hücrelere doğal ızgaraya yapışmaz, ve diğerleri kaplama ızgara ilk poli-L-lizin,% 0.1 ızgara uyması istenebilir. Dondurmadan önce hücre konsantrasyonu uygun olduğundan emin olmak için ilk ışık mikroskobu ızgaraları kontrol edin. II. Dalma donma ince hücreler Ince bakteri hücreleri için, sağlam hücreleri süspansiyon bir EM ızgara boyunca dondurulmuş dalma. Bu süreç, bakteri hücrelerinin ultra-yapısını korur ve daha sonra EM yüksek vakum su buharlaşmasını önlemek olacaktır. Ismarlama dalma dondurma cihazları ile yapılır, ya da biz ticari bir otomatik dalma derin dondurucu, burada gösterdiği gibi, FEI Vitrobot MKIII 4 olabilir 2 Glow deşarj karbon kaplamalı EM ızgara – 4 dakika. Bu ızgara hidrofilik bir yüzey oluşturur, böylece tüm şebeke genelinde örnek eşit olarak yaymak için yardımcı. % 5 konsantre BSA çözüm 25μl ile 100μl kolloidal altın çözüm (10 nm partikül çapı) karıştırın. BSA kat altın parçacıklar ve bu onların agregasyonunu önler. 18000g BSA ve altın partikül karışımı 15 dakika boyunca santrifüjleyin. Süpernatantı çıkardıktan sonra, kalan altın pelet 20 ul hücre çözümü ile karıştırılır. BSA tedavi altın parçacıkları hücreleri ile reaksiyona girmez, ancak tomogram fiducial belirteç olarak yeniden inşası için gerekli olacak. Hücre ve altın çözüm karışımı% 100 nemde Vitrobot EM ızgara taburcu kızdırma 4 ul uygulayın. Izgara sonra otomatik olarak her iki taraftan No 1 filtre kağıdı ile lekelenen. Bu sadece kendi medya hücrelerin ince bir film tabakası kalır, böylece fazla sıvıyı kaldırır. Izgara sonra bir sıvı etan, propan, sıvı azot ile yaklaşık 77K soğutulur karışımı içine hızla daldı. Bu işlem sırasında, örnek, ince filmler <1 mikron buz kristalleri oluşumu önlenir, böylece hızla dondurulur. Izgara etan / propan karışımı dikkatlice çıkarın ve hızlı bir şekilde sıvı azot altında tutulur bir ızgara saklama kutusu içine aktarmak. III. Kalın Hücreler Kesit Yüksek Basınç Dondurma ve Cryo Kalın hücreleri için, yüksek basınç dondurma buz kristalleşme azaltır ve sonraki cryo kesit vermektedir EM görüntüleme için yeterince ince örnekleri 5, 6, 7 yüksek basınç dondurma için birçok farklı örnek sahipleri vardır, seçimi, örnek türü bağlı olacaktır dondurma makinesi veya soruşturma uygulama seçilir. Burada Bal-Tec HPM 010 yüksek basınç dondurucu ve Leica Microsystems cryo ultra mikrotom modeli UC6/FC6 kullanın. 15mls spinner kültür OD> 0.5, bakteriler için 37 ° C inkübatör doğrudan alınır ve 3 dakika 1000rpm santrifüj. 15 saniye sonra kalan kültür pelet supernatant, mix 0.5 ml, 0.5 ml% 20 dekstran dölveriminin kaldırılması ve sonra 13000rpm santrifüjlenir. Süpernatant çıkardıktan sonra, süper pelet pipet 0.1ml zaten 0.2ml% 20 dekstran cryoprotecant (40000Mwt) içerir ısı sızdırmaz mikropipet ucu içine yapıştırın. 13000 rpm'de 30 saniye boyunca mikropipet uç karışımı Santrifüj ve süpernatant kaldırmak. 5-10 ul sıkı pelet kapalı ucunda görülür. "Teflon" kaplı pirinç kubbeli, yüksek basınç dondurucu tutucu kol levhası hazır monte edilmiş bir yarım kubbe yapıştırın alır ve düz ortağı pirinç şapka ile mühürlenir. Kol montaj sonra derhal hazır dondurma astarlanmalıdır yüksek basınç dondurucu içine eklenir. Hücreleri içeren kombine pirinç levhası birim 2100 bar basınç, yüksek basınç sıvı nitrojen bir jet hızla soğutulur, kol anında montaj çıkarılması ve sıvı azot banyo içine dalan ısınma levhası önler. Cryo-kesit için gerekli olan kadar levhası birimleri, sıvı azot altında saklanır. Kesit hücrelerinin iyi dondurulmuş kubbe göstermek için, iki pirinç sikke levhalarının dikkatle unde ayrılırr sıvı azot. Hücre mükemmel dondurulmuş kubbe, görünüm camsı çatlak ve buz çekirdeklenme çatlaklar ücretsizdir. Bu levhası precooled -170 ° C kamara aktarılır ve cryo mikrotom yardımcısı gibi Chuck güvenli bir şekilde monte edilir. Soğutmalı cryomicrotome kesit için gerekli temel cryotools içerir, bu şunlardır: düşük bir açı cryo-elmas bıçak, bir elmas kırpma aracı, basın platformu, ızgara saklama kutusu, anti-statik sprey ünitesi ve bir ızgara tutan aparat. Iyi dondurulmuş çevre ~ 200μm derinliği koruyarak bir dış kubbe bölge kesit başarılı şerit başlangıçta elmas kırpma aracı ve hızlı bir kesit hızı <0.2mm kare şeklindedir. Düşük açılı bıçak ve yakın bakır destek ızgaraları yönelik antistatik sprey ile, elmas bıçak kesit için hazır cilalı blok yüz dikkatle ileri. Mikrotom parametreleri ~ 0.4mm/sec ve dar kesim penceresinde bir kesme hızı ile birlikte, 50 ila 350 nm arasında bir kesit kalınlığı ayarı olarak seçilmiştir. Hemen alan düşük nem koşullarında antistatik sprey aralığı ve şiddeti kontrol etmek için önemlidir. Ilk bölümlerde olduğu gibi ince bir kirpik aplikatör elle veya mikromanipülatör manevra düşük açılı elmas bıçak sırtı kaymasını erken bölümleri dolanabilir. Bölümleri şerit bıçak zorunda olsa da, onlar hafifçe kirpik prob tarafından desteklenen ve yakın bakır grid desteği boyunca rehberlik. Bölümleri sopa, kurdeleler yüklü ızgara sonra arşa cilalı gümüş soğutulmuş prob kullanarak basıldığında, bazı bölümlerde çok yüksek son antistatik cihazlar yapıştırma işlemine yardımcı olabilir ücret uygulanır. Izgara kutuları mikroskop ızgara transferi için hazır olana kadar kuru gönderen soğutulan bir sıvı nitrojen içinde uzun süreli saklama için tutulur. IV. Cryo Işık Mikroskobu kullanılarak Hücreler inceleyin Izgara üzerinde bakteri hücrelerinin cryo ışık mikroskobu (cryoLM) kullanılarak görüntülenebilir. Burada kullandığımız mikroskop, özel bir Nikon ters mikroskop ekstra uzun çalışma mesafesi (ELWD) 60x hava objektif lens ile Ti E / B. Izgaraları ışık mikroskobu için modifiye edilmiş bir FEI cryo sahne görüntüleme sırasında bir cryo aşamasında tutulur. Bulucu ızgara kullanarak, hücreleri, ızgara kareler yer ve cryoLM görüntüler cryoEM tomogram korelasyon. Izgaraları cryo istasyonu kartuşları içine yükleyin. Kartuşları özel FEI TF30H Polara için standart EM kartuş değiştirilmiş. Izgara bakır klip halkaları ile yapılır. Kartuş sonra transfer için sıvı nitrojen içinde bir tüp içinde muhafaza edilir. Sıvı azot sıcaklığı (-190 ° C) cryo sahne serinleyin. Cryo aşamaya kartuşunu yükleyin ve görüntüleme penceresi içine ızgara taşımak. Sahne, iki özel modifiye kartuşları tutabilir. Yoğunlaştırıcı lens Alt ve ızgara üzerine 60x objektif lens odak. Hücreleri bulun ve görüntüleri çekin. Korelasyon LM ve EM çalışma için, ızgara, daha sonra EM hücreleri bulmak için, hücrelerin alanı çevresinde taranır. Görüntüleme sonra ızgara, tüpe kartuşu geri koymak ve EM imaged hazır olana kadar sıvı azot tüpü tutmak. V. Cryo TEM Tilt Serisi toplayın Örnek artımlı cryo TEM bir ya da iki eksen boyunca hareket ettirildiğinde bir 3D tomogram bakteri hücre elde etmek için, bir dizi projeksiyon görüntüleri alınır. Göz önüne alındığında, eğim açıları ve diğer deneysel ayarları otomatik olarak tilt serisi toplamak için çeşitli farklı yazılım vardır. Biz FEI TF30H-Polara cryo TEM için Leginon kullanın. Bu otomatik olarak önceden seçilmiş hücrelerin eğim dizi çekmek için izin verir. 8 Kartuşları precooled cryo istasyonunda çoklu seçim tutucu (MSH) yükleyin. MSH 6 kartuş kadar tutabilir. TF30H-Polara MSH bağlayın, bir kartuş almak ve EM sütunu yerleştirin. EM bilgisayar ve diğer iş istasyonu Leginon ana program Leginon-client başlayın. Bir Leginon oturum için hazır ayarları (resim koşulları) ayarlayın. Önemli parametreler büyütme altında odağı değeri, elektron dozu ve başlangıç ​​açısı, uç açısı ve artışlarla da dahil olmak üzere, tilt serisi için eğim açılarına,. En düşük büyütme başlayan görüntülerde hedefler seçin ve yüksek büyütme ile bir sonraki adıma gönderebilirsiniz. Tilt-serisi toplanması için tüm hedeflerini Kuyruk ve hepsi son "tomografi" adım teslim. Veri toplama sürecinde, yerel bir iş istasyonundan web aracı ile izlenebilir. Deneysel veri toplama aşağı yapıldıktan sonra,yeniden inşası için yerel bir iş istasyonu üzerine tamamlanan tilt serisi yükleyin. VI. Biyogüvenlik düşünceler Birlikte çalıştığımız biyolojik örneklerin çoğu patojen olmayan ve toprak, musluk suyu veya böcek bağırsak izole edilmiştir. Temel aseptik teknik Bu örneklerin işlemek için yeterli. Patojenler ile Çalışma Ancak aşırı tehlikeler için, bazı laboratuarları BSL-3 laboratuvarları içinde tüm cryo-EM mikroskoplar yüklü ek güvenlik adımları uygulanmasını gerektirir. Aşağıdaki laboratuarımızda patojen ile çalışma riski azaltılmış yollarından bazılarıdır. Bir örnek patojenite ya kimyasal ya da genetik olarak zayıflatılmış olabilir. Virüs cryo-EM yapan birçok laboratuvar dalma donma önce kimyasal fiksatif ile inaktive var. Alternatif olarak, anahtar mutasyonlar hale nokta mutasyonlarının belirli enzimler inaktive veya reseptörleri nakavt örneğin örnekleri de dahil olmak üzere-enfektif olmayan, sokulabilir. Eldiven, laboratuvar önlüğü ve gözlük gibi kişisel koruyucu giysiler giyilmelidir. Tehlikeli örnekleri bir Biyogüvenlik kabini (BSC) ele alınabilir. Bakteri kültürleri, büyüdü, konsantre ve hatta EM üzerine BSC ızgaraları dalma dondurulmuş olabilir. Biz, bu amaç için BSC sığar bir küçük, manuel dalma dondurma cihaz var. Otomatik dalma-dondurucular tarafından sunulan daha fazla tutarlılık ihtiyaç varsa, onlar da BSC içine, ya da daha basitçe, bazı durumlarda cihazın bulaşmasını önlemek için alüminyum folyo ile bizim Vitrobot blot pedleri destek verdi. Bir BSC ile çalışan, gibi alet ve malzemelerin birçok kabine girmeden veya dışında% 70 etanol ile dezenfekte edilmelidir. Izgaraları hazırlanıyor, biz whatman kağıt lekelenen alır çoğu bakteriyel veya viral kültür küçük hacimli (genellikle 4 ul) kullanın. Blot kağıt, pipet uçları, ve kalan kültür biyolojik tehlikeli atık olarak bertaraf edilir. Tüm araçları ve maruz yüzeylerde, sulandırılmış çamaşır suyu,% 95 etanol ve sonra su ile dezenfekte edilmektedir. Izgaraları dondurulmuş sonra, depolama ve veri toplama boyunca sıvı nitrojen sıcaklıklarda tutulur. Bu hücreler daha sonra donma çözülme ve hayatta olduğunu göstermiştir olmuştur, ancak, bu yüzden, veri toplama ve saklama boyunca tehlikeli olarak onları tedavi etmek için devam ediyor. Veri toplama sonunda, dondurulmuş ızgaraları içeren kartuşlar cryo-TEM kaldırılır ve doğrudan% 70 alkol içine düştü. Nadir olmasına rağmen, bazen ızgaraları sütun içinde "düştü" olduğu not edilmelidir, ve böyle bir olayın sonuçlarını her tehlikeli örnek için düşünülmelidir. Mikroskop çoğu oda sıcaklığında bırakılan bir ızgara üzerinde örnek muhtemelen sütun içinde çözünme ve tamamen EM ultra-yüksek vakum kurutulmuş olacaktı. Bu tabii ki bazı biyolojik örneklerin inaktive olur, ama belki de değil sağlam virüsler ve kurumuş kalıntıları örnek mikroskop sütununda sonraki servis için açılan aerosoller potansiyel olarak serbest olabilir. VII. Tomogram İmar Bakteri hücrelerinin tomogram yazılım aracılığıyla yeniden. Bu iş için çeşitli yazılımlar vardır. Biz Raptor otomatik olarak yeniden yapılanma ve tarama tomogram için kullanın. 9 otomatik eğim dizi hizalama ve sonraki yeniden yapılanma olmayan önemsiz bir görev olduğu gibi, Raptor henüz% 100 başarı oranı var değildir . Raptor yetmezliği ya da yüksek kaliteli bir yeniden yapılanma için ihtiyaç olması durumunda, manuel resmi hizalaması ve eTomo IMOD tomografi yazılım paketi ile rekonstrüksiyon 10, 11 Yerel Leginon web sunucusu her bir eğim serisi indirin. Kolayca bulunan bir dizinde saklayın. El IMOD Kullanıcı 3dmod görüntüleyici kullanarak eğme serisi incelemek ve Leginon hedef izleme ya da yararlı bir eğim seri üretiminde başarısız olduğunda bu atın. Biz Raptor Şeftali (bir ağ üzerinden görevleri dağıtmak için Pearl-tabanlı sistem) ile laboratuarda dağıtılan Linux makine üzerinde çalıştırmak. Koloidal altın parçacıkları, yani bizim fiducial belirteçlerin boyutu belirtmek yeniden inşası için kullanılacak belirteçler, piksel boyutu, rekonstrüksiyon istenilen kalınlıkta, binning faktörü ve temel ayarları böyle bir girdi olarak bir sayı (sayı, 122-görüntü-veri kümesi (2k tarafından 2k) 2s genellikle 20dk çalıştırmak için çıkış yolları ve çıkış komut satırı biçimi) ve bırakın. Yeniden yapılanma sonucu memnun ise, bu bölümde aşağıdaki adımları atlanabilir. Manuel yeniden yapılanma gerektiğinde, "mrc" dosya "st" olarak yeniden adlandırın ve IMOD tomografi paketi eTomo GUI bireysel tilt serisi yük. Tilt serisi eksen tipi (tek veya çift eksen) belirtin ve sa kullanılan fiducial boyutu girmekmple hazırlanması. Piksel boyutunu belirlemek ve "Com scriptleri oluşturma" tıklayarak devam etmek için dosya başlığı tarayın. Tilt serisi tomogram yeniden eTomo GUI her sekme adımları izleyin. Kontrol edin ve her adımdan sonra sonucu doğrulamak, ve eğer memnun değil, biz her zaman oradan herhangi bir önceki adımı ve işleyemeyiz geri gidebilirsiniz. "Ön-işleme" hazırlık işlem gerçekleştirmek ve X-ışınlarının neden olduğu yüksek yoğunluklu piksel anormal kaldırmak için. "Kaba hizalama" eğim dizi izleyen her projeksiyon görüntü çapraz korelasyon önceki hizalanır neyin bir tilt serisi üretir. "Fiducial Model Nesil" fiducials olarak kullanmak için altın boncuk tanımlamak ve program her projeksiyon görüntü fiducial işaretleri izler ve "Güzel Hizalama" oluşturur. "Tomogram Konumlandırma" Z. tomogram kırpma sağlar "Final Bağlantısızlar Yığın" lineer interpolasyon ve CTF-düzeltme, Altın Silgi ve 2D-filtreleme opsiyonel olarak uygulanabilir gibi fonksiyonları kullanarak oluşturulur. Tomogram Fourier uzayda ağırlıklı arka projeksiyon "Tomogram üret" hesaplanır. "Post-processing" Faiz ve ölçekleme ilgi yapıların aralığında kontrast XY bölgeye tomogram kırpma sağlar ve ara dosyaları siler "Clean Up" ve disk alanını boşaltır. VIII. Veritabanı tomogram Depolama Biz bir web tabanlı in-house düzenlemek için veritabanı, mağaza, arama ve tomografi verileri dağıtmak kullanın. Her tilt serisi için, biz örnek detayları, mikroskop toplama parametreleri, ham tente serisi yanı sıra ilişkili 3D yeniden yapılanma ve diğer işlem dosyaları kaydedebilirsiniz. Ana tarama sayfa küçük bir görüntü sunar ve her tomogram için özellikli bir film gibi "YouTube", ve girişleri indirme frekans, yaratıcısı, numune türü veya tarihe göre organize edilebilir. Kullanıcılar, anahtar kelimeler veya özel özellikler girerek veritabanı arama yapabilirsiniz. Şu anda, 11.000 'den fazla ilişkili dosyaları toplam 4.500' den fazla tomografik tilt serisi, yaklaşık 60 tür / örnek türleri kapsayan veritabanında tevdi edilmiştir. IX. Tomogram Analizi ve Segmentasyon Tomogram yapısal detayları görüntülenebilir ve görüntü işleme araçları, örneğin ZAP, XYZ ve Dilimleme pencere ile IMOD 3dmod görüntüleyici ile farklı bir yazılım ile analiz edilebilir. Bir sonraki adım, 3D görüntü (tomogram) bir segmentasyon oluşturmak için. 3D görüntü her voksel (hacimsel piksel) bir segmentasyon hangi bölge veya malzeme voksel örneğin, bir zar veya hücre iskeletinin ait açıklayan bir etiket atar. Biz de 3dmod IMOD ve Amira (Visage Görüntüleme) gibi yazılım araçlarını kullanıyor. Bazı yazılım araçları otomatik bölümleme modülleri (örn., eşik segmentasyon) sağlasa da, çoğu zaman sadece yüksek kontrastlı görüntüler için çalışmak. Düşük doz elektron cryotomography türetilen 3D görüntüler çoğu durumda elle her voksel için bir etiket atamak olduğu gibi düşük kontrastlı var. Segmentasyon ayrı bir veri dosyasında saklanır. Bu, her bölgeye farklı bir renk ile gösterilir ve 3D görüntülenebilir olduğu bir yüzey modeli oluşturmak için kullanılan olabilir. Tomogram diğer analiz için kullanılabilir. Örneğin, şablon eşleme ve sonraki hesaplama ribozomlar gibi makromoleküler kompleks istatistiksel bilgi verebilmesidir. Subvolume hizalama ve ortalama, daha yüksek kontrast yapılar gösterir ve ince ayrıntıları ortaya koyar. X. tomogram üzerine film yapma Biz her proje özetlemek ve tomografik görsel bir tur vermek filmler yapmak. Göstermek ve bu özellikleri nasıl işlemek için istiyorum veri özellikleri bir komut dosyası olun. Örneğin, tipik bir film tam hücreli tomografi proje, daha sonra yeniden inşa tomogram bir dilim dilim görünümü takip temsili bir eğim serisi verileri gösteren ve başlar. Sonra, örneğin, hücre içinde önemli makromoleküllerin bir segmentasyon, flagellar motor veya kemoreseptör kompleksi veya sitozolik filament göstermektedir. Son olarak, idealize edilmiş bir yorumu okuyan makromoleküllerin gösteren bir model sonucuna varıldı. Grafik Amira veya Chimera olarak temsil yazılım, film bireysel fotoğraf kareleri işlemek için kullanılır. Biz her klibin değişiklik kolaylaştırmak için genellikle kısa klipler filmleri bir araya getirin. Adobe Premiere gibi ticari film düzenleme yazılımı, son film içinde film klipleri haline fotoğraf çerçeveleri, ve sonra da film klipleri birleştirmek için kullanın. Biz film anlatıcısı bir ses kaydının da eklemeye başladılar. Anlatım bir "film efsane" gibi davranan ve seyirci film izlerken verileri sunulmaktadır odaklanmasını sağlar. XI. Animasyon Görselhikaye anlatımı, belirli bilimsel etki karmaşık kelime gerektirmeden bilgi iletişim kurar. Zor kavramları görsel gösteri eşliğinde basit hale gelir. Karikatürler biyolojik fikirler gösteren uygulama yeni değil. Ancak, sadece son on yıl içinde profesyonel 3D içerik oluşturma, bilimsel animasyonlar inşa görevi ayı getirilmiştir sofistike araçlar var. Şimdi araştırmacılar, aktif, dinamik 3D animasyonlar, biyolojik sistemlerin çeviri onlarca vardır. Pek çok güzel animasyonlar http://MolecularMovies.org sergilendi . Bu sitede öğreticiler de ev sahipliği yapan ve Autodesk Maya moleküler yapıları manipüle için ücretsiz bir araç seti dağıtır. Açık kaynak kodlu 3D içerik paketi, Blender, birçok kullanıcı tarafından oluşturulan PDB ithalatçılar içerir. 3D animasyon yapma süreci genellikle üç adımdan oluşur: Modelleme: Maya ithal edilebilir biçimleri içine yüzeyleri ihracat grafik temsili yazılımı kullanmak. Bu yüzeyler yeniden inşa tomogram segmentlerinin ya, örneğin, membranlar, granül veya filamentler, ya da moleküler yüzeyler temsilleri. Tomogram segmentlerinin Amira yapılmaktadır; moleküler yüzeyler Chimera veya VMD üretilir. Moleküllerin atomik temsilleri PDB dosyaları Maya doğrudan alınabilir. Maya içindeki modellerin sonra, onlar, modifiye çoğaltılamaz, ve uygun şekilde yerleştirilmiş olabilir. Animasyon: Animasyonlar geleneksel sanatçı, hareketli nesneleri elle taşıma ve bir dizi anahtar kare kayıt, el tarafından inşa edilmiştir. 3D grafik yazılımı Yeni gelişmeler artık yerleşik modülleri ve komut dosyası API'ler üzerinden dinamikleri procedurally üretilen izin. Rendering: Usul dinamikleri self-montaj yapısal gibi dinamik biyolojik süreçlerin, ikna edici animasyonlar sağlayabilir. Ancak gerçekçi biyolojik sistemlerin simüle zorluk nedeniyle, 3D animasyonlar çoğunluğu hala geleneksel anahtar kare teknikleri kullanılarak inşa edilmiştir. Dinamikleri sipariş sonra, görsel şerhler, doku ve ışık efektleri eklenebilir. Son olarak, kameranın yolu seçilir ve tamamlanmış animasyon bir film çevrildi.