Cryotomography électrons des cellules bactériennes

I. Préparation de culture de cellules bactériennes Cultivez les cellules bactériennes dans leurs médias normale à la phase souhaitée dans une culture liquide quelques ml. Si une concentration plus élevée est nécessaire, le filage et la remise en suspension dans des milieux frais peuvent être adoptées, mais être conscient que ce processus introduit parfois des changements structurels dans les cellules. Vérifiez dans le microscope à lumière pour s'assurer que la culture est exempt de contaminants et à un confluent approprié. Certaines cellules bactériennes peuvent coller ou même se développer sur les grilles EM. Lorsque des cellules en croissance sur des grilles, des grilles d'or avec un manteau de carbone sont le plus souvent utilisé pour éviter la toxicité pour les cellules. Ils doivent être déchargées lueur pendant 2 minutes, stérilisé sous une lumière UV pendant 15 minutes, et placée directement dans le liquide de culture. Les cellules adhérentes seront naturellement s'en tenir à la grille, et d'autres peuvent être invité à adhérer à la grille par revêtement de la grille dans 0,1% de poly-L-lysine premier. Vérifiez les grilles au microscope optique d'abord pour s'assurer de la concentration de cellules est appropriée avant de les congeler. II. Plongez la congélation des cellules minces Pour minces cellules bactériennes, la suspension des cellules intactes est plongent congelés travers une grille d'EM. Le processus qui préserve la structure ultra des cellules des bactéries et empêche l'évaporation de l'eau dans le vide poussé de l'EM tard. Il peut être fait soit avec les dispositifs sur mesure de gel plonger, ou comme nous le montrons ici, avec un congélateur plongent automatiques commerciales, la FEI Vitrobot MKIII 4. Décharge luminescente du revêtement de carbone EM grille pour 2 – 4 minutes. Cela rend la surface de la grille hydrophile, aidant ainsi à répandre uniformément l'échantillon à travers la grille entière. Mélanger 100 ul solution d'or colloïdales (diamètre des particules de 10 nm) avec 25 pi d'une solution de BSA 5% concentré. Les manteaux de BSA les particules d'or, ce qui empêche leur agrégation. Centrifuger les BSA et le mélange de particules d'or à 18000g pendant 15 minutes. Après élimination du surnageant, le culot est d'or restantes mélangés avec 20 ul solution cellulaire. Les particules d'or BSA traités ne réagissent pas avec les cellules, mais ils seront nécessaires tant que marqueurs fiduciaires pour la reconstruction de l'tomogrammes. Appliquer 4 pl de la cellule et le mélange de solution d'or à la lueur déchargée grille de EM dans le Vitrobot à 100% d'humidité. La grille est alors automatiquement effacé des deux côtés avec Nr. 1 papier filtre. Cela supprime l'excès de liquide, de sorte que seul un film mince de cellules dans leurs médias demeure. La grille est ensuite plongé rapidement dans un mélange liquide d'éthane et de propane qui est refroidi à environ 77K à l'azote liquide. Pendant ce processus, l'échantillon est congelé si rapidement que la formation de cristaux de glace est empêché dans des films minces <1 um. Retirez délicatement la grille à partir du mélange d'éthane / propane et transférer rapidement dans une boîte de stockage réseau qui est maintenu sous azote liquide. III. La congélation à haute pression et Cryo de sectionnement des cellules plus épaisses Pour plus épais cellules, congélation à haute pression réduit la cristallisation de la glace et ultérieures sectionnement cryo rend échantillons assez mince pour EM imagerie. 5, 6, 7 Il ya beaucoup de porte-échantillons différents disponibles pour la congélation haute pression, votre choix dépendra de l'échantillon, le type de machine de congélation utilisé ou l'application d'enquête choisi. Ici, nous utilisons Bal-Tec 010 HPM congélateur à haute pression et cryo ultra microtome modèle UC6/FC6 de Leica Microsystems. Pour les bactéries, la culture 15mls spinner DO> 0,5 est pris directement à partir de l'incubateur à 37 ° C et centrifugés à 1000rpm pendant 3 minutes. Après avoir retiré le surnageant 0.5ml mélange, de la culture culot restant avec 0,5 ml de dextran 20% cryoprotecteur puis centrifuger à 13000rpm pendant 15 secondes. Après avoir retiré le surnageant, 0.1ml pipette de la pastille super-coller dans la pointe micropipette thermoscellés qui contient déjà 20% de 0.2ml dextrane cryoprotecant (40000Mwt). Centrifuger le mélange dans la pointe micropipette à 13000 rpm pendant 30 secondes et retirer le surnageant. A 50-10 ul serrés culot est vu à la pointe de scellés. Un "Téflon" laiton en forme de dôme recouvert montée Planchet prêt dans les bras de support de haute pression de congélation reçoit la pâte dans un demi-dôme et est scellé avec son chapeau en laiton partenaires plat. Le bras est alors immédiatement inséré dans le congélateur à haute pression apprêté prêt pour la congélation. A 2100 bar de pression de l'unité combinée de laiton Planchet contenant les cellules est rapidement refroidi par un jet d'azote liquide à haute pression, en supprimant l'ensemble bras instantanément et se plonger dans un bain d'azote liquide empêche le Planchet du réchauffement. Planchet unités sont stockées sous azote liquide jusqu'au moment de la cryo-coupes. Pour exposer le dôme bien congelés de cellules pour la coupe, les deux flans de laiton sont soigneusement séparés UEDNr l'azote liquide. Le dôme parfaitement congelé des cellules présente un aspect vitreux, exempts de fissures et les crevasses nucléation de la glace. Cette Planchet est transféré à un prérefroidi -170 ° C chambre et solidement monté sur le cryo-microtome le vice-comme Chuck. Le cryomicrotome refroidi contient cryotools essentielles nécessaires pour la coupe, ils comprennent: un angle faible cryo-diamants couteau, un outil diamanté coupe, la plate-forme de presse, boîte de rangement de grille, une unité de spray anti-statique et un appareil de la grille de maintien. Pour ruban de succès sectionner une région dôme extérieur est d'abord façonné à la case <0.2mm par l'outil de rognage et de diamants une vitesse rapide de sectionnement, tout en conservant la profondeur ~ 200μm du périmètre bien gelés. Avec le spray antistatique dirigé le couteau angle faible et les grilles support en cuivre à proximité, le couteau de diamant est soigneusement avancé à la face du bloc polis préparé pour la coupe. Microtome paramètres sont choisis, comme une mise en épaisseur de coupe entre 50 à 350 nm, avec une vitesse de coupe de ~ 0.4mm/sec et la fenêtre de coupe étroite. Il est important de contrôler la gamme spray antistatique et l'intensité des conditions de faible humidité dans la zone immédiate. Comme les premières sections sont produits un applicateur cils amende est manoeuvré à la main ou à accrocher micromanipulateur les premières sections glisser le bord angle faible de diamants couteau. Alors que le ruban de sections est forcé hors du couteau, ils sont délicatement soutenu par une sonde de cils et guidé à travers le support de grille en cuivre à proximité. Pour coller les sections, la grille chargée avec des rubans est alors fermement pressé en utilisant un refroidissement polies-argent sonde, certaines sections sont donc très chargé les derniers appareils antistatiques peuvent aider dans le processus d'adhésion. Grille boîtes sont conservés pour le stockage à long terme dans l'azote liquide refroidi expéditeur sec jusqu'à la microscope est prêt pour le transfert de la grille. IV. Examiner les cellules en utilisant le microscope optique Cryo Les cellules bactériennes sur la grille peut être imagée en utilisant le microscope optique cryo (cryoLM). Le microscope que nous utilisons ici est un microscope inversé Nikon personnalisée Ti E / B avec la distance de travail extra-longue (ELWD) lentille de l'objectif 60x air. Les grilles sont conservés dans un stade de cryo lors de l'imagerie, qui est une version modifiée FEI cryo scène pour microscope optique. En utilisant une grille de viseur, les cellules peuvent être situés sur les places de grille et les images cryoLM être corrélée à la tomogrammes cryoEM. Charger des grilles dans des cartouches sur le cryo-station. Les cartouches sont modifiés sur mesure à partir de notre EM cartouche standard pour la FEI TF30H-Polara. La grille est maintenue par des anneaux clip de cuivre. La cartouche est alors maintenu dans un tube dans l'azote liquide pour le transfert. Refroidir la phase à température cryogénique d'azote liquide (-190 ° C). Chargez la cartouche dans le stade de cryo et déplacer la grille dans la fenêtre de visualisation. Le stade peut contenir jusqu'à deux cartouches personnalisée modifiée. Abaissez le condenseur et de se concentrer l'objectif 60x sur la grille. Trouver les cellules et de prendre des images. Pour LM corrélation et l'étude EM, la grille est scanné autour de la zone des cellules, permettant de localiser les cellules tard dans EM. Après l'imagerie de la grille, placez la cartouche dans le tube et maintenir le tube dans l'azote liquide avant d'être prêt à imager dans EM. V. Collecte série Tilt dans le TEM Cryo Pour obtenir une tomographie 3D de la cellule bactérienne, une série d'images de projection sont prises alors que l'échantillon est progressivement inclinée le long d'un ou deux axes dans le TEM cryo. Compte tenu de l'angle d'inclinaison et d'autres paramètres expérimentaux, il existe plusieurs logiciels différents disponibles pour recueillir automatiquement des séries d'inclinaison. Nous utilisons pour nos Leginon TEM cryo qui est FEI TF30H-Polara. Il permet de prendre automatiquement la série d'inclinaison de cellules présélectionnées. 8 Charger les cartouches dans le support multi-sélection (MSH) sur la station prérefroidi cryo. La MSH peut contenir jusqu'à 6 cartouches. Connectez la MSH à l'TF30H-Polara, ramasser une cartouche et l'insérer dans la colonne EM. Démarrer Leginon-client sur l'ordinateur EM et Leginon programme principal sur l'autre poste de travail. Mettre en place des présélections (conditions d'image) pour une session Leginon. Les paramètres importants sont le grossissement, la valeur se concentrer moins, la dose d'électrons et les angles d'inclinaison pour les séries d'inclinaison, y compris l'angle de départ, angle de fin et incréments. Choisissez des cibles sur des images à partir de grossissement le plus faible et les envoyer à l'étape suivante avec un plus fort grossissement. La queue toutes les cibles pour l'inclinaison de la série de collecte et de soumettre chacun d'eux à la finale de «tomographie» étape. Le processus de collecte de données peut être contrôlé via le web-outil à partir d'un poste de travail local. Après la collecte des données expérimentales est fait, en baissecharger le complété d'inclinaison de la série sur un poste de travail local pour la reconstruction. VI. Considérations de biosécurité La plupart des échantillons biologiques avec lesquels nous travaillons sont non-pathogènes et ont été isolés du sol, l'eau du robinet ou de l'intestin des insectes. Base technique aseptique est suffisante pour la manipulation de ces échantillons. Travailler avec les agents pathogènes nécessite la mise en œuvre de mesures de sécurité supplémentaires, mais pour les risques extrêmes, certains laboratoires ont installé toute la cryo-EM microscopes dans les laboratoires BSL-3. Les éléments suivants sont quelques-unes des façons dont nous avons réduit le risque de travailler avec des agents pathogènes dans notre laboratoire. La pathogénicité d'un échantillon peut être atténué soit chimiquement ou génétiquement. Beaucoup de laboratoires faisant cryo-EM de virus inactivés ont entre eux avec des fixateurs chimiques avant de plonger au point de congélation. Comme alternative, les mutations peuvent être introduites clés qui rendent les échantillons non-infectieux, y compris par exemple l'inactivation des mutations ponctuelles dans certaines enzymes ou récepteurs assommant. Équipement de protection personnelle tels que gants, blouse et lunettes doivent être portées. Les échantillons dangereux peuvent être manipulés dans une armoire de la biosécurité (BSC). Les cultures bactériennes peuvent être cultivés, concentré, et même plongée gelé sur EM grilles dans le BSC. Nous avons un plus petit, manuel plongent-gel dispositif qui s'inscrit dans notre BSC à cet effet. Si la plus grande cohérence automatiques offertes par plongent-congélateurs est nécessaire, ils peuvent soit être introduit dans le BSC, ou, plus simplement, dans certains cas, nous avons soutenu le sous-main de notre Vitrobot avec du papier aluminium pour empêcher la contamination de l'appareil. Lorsque vous travaillez avec un BSC, comme la plupart des outils et des matériaux que possible d'entrer dans ou hors de l'armoire doivent être désinfectés avec de l'éthanol à 70%. Lors de la préparation de nos grilles, nous utilisons de petits volumes d'une culture bactérienne ou virale (habituellement de 4 ul), dont la plupart se effacé par le papier Whatman. Le papier buvard, des embouts de pipette, et la culture restants sont éliminés comme des déchets biologiques dangereux. Tous les outils et les surfaces exposées sont désinfectés avec eau de Javel diluée, 95% d'éthanol et d'eau. Une fois les grilles sont congelés, ils sont maintenus à des températures d'azote liquide à travers la collecte de stockage et des données. Il a été démontré que les cellules peuvent survivre à la congélation puis décongélation, cependant, alors que nous continuons à les traiter comme dangereux durant la collecte de stockage et des données. A la fin de la collecte des données, les cartouches contenant les grilles congelés sont retirés de la cryo-MET et déposés directement dans l'alcool à 70%. Bien que rare, il convient de noter que, parfois, les grilles sont «laisser tomber» l'intérieur de la colonne, et les conséquences d'un tel événement devrait être envisagée pour chaque échantillon dangereux. La plupart du microscope est à la température ambiante, donc l'échantillon sur une grille aurait probablement chuté de dégel intérieur de la colonne et devenir complètement desséché dans le vide ultra-haute de l'EM. Ce serait évidemment inactiver certains échantillons biologiques, mais peut-être pas des virus robustes, et les restes desséchés de l'échantillon pourrait être libérée sous forme d'aérosols lorsque la colonne de microscope est à côté ouvert pour le service. VII. Tomogram reconstruction Les tomographies des cellules bactériennes sont reconstruits par le logiciel. Il existe plusieurs logiciels disponibles pour cet emploi. Nous utilisons Raptor pour la reconstruction automatique et tomogrammes dépistage. 9 Comme l'alignement automatisé séries d'inclinaison et la reconstruction est une tâche non triviale, Raptor ne dispose pas actuellement d'un taux de réussite de 100%. Dans le cas de l'échec de Raptor ou la nécessité d'une reconstruction de grande qualité, nous utilisons l'alignement d'image manuel et de la reconstruction avec eTomo dans la suite logicielle IMOD tomographie. 10, 11 Téléchargez chaque série d'inclinaison individuels depuis le serveur web Leginon locales. Enregistrez-les dans un répertoire où ils peuvent facilement être localisés. Inspecter manuellement la série d'inclinaison à l'aide spectateur 3dmod IMOD et jetez celles où Leginon n'a pas suivi la cible ou de produire une série d'inclinaison utile. Nous courons Raptor répartis sur les machines Linux dans le laboratoire par Peach (un système basé sur Perle de répartir les tâches sur un réseau). Nous préciser la taille de nos marqueurs fiduciaires, à savoir les particules d'or colloïdales, le nombre de marqueurs à utiliser pour la reconstruction, le pixel de taille, l'épaisseur souhaitée de la reconstruction, le facteur de binning et d'un certain nombre de paramètres de base (comme les entrées, chemins de sortie et le format de sortie) sur la ligne de commande et de le laisser courir, généralement à 2h 20min pour un 122-image-ensemble de données (2k par 2k). Si vous êtes satisfait avec le résultat de reconstruction, les étapes ci-dessous dans cette section peut être sautée. Lorsque la reconstruction manuelle est nécessaire, renommer les fichiers à partir ». MRC" à ". St» et force de la série d'inclinaison individuels dans le GUI eTomo dans la suite de la tomographie IMOD. Spécifiez le type axe d'inclinaison séries (axes simple ou double), et entrez la taille repères utilisés dans les SApréparation mple. Balayage l'entête du fichier afin de déterminer la taille des pixels, et procéder en cliquant sur "Créer des scripts Com". Suivez les étapes de chaque onglet dans l'interface graphique eTomo pour reconstruire la tomographie de la série d'inclinaison. Inspecter et vérifier le résultat après chaque étape, et s'il n'est pas satisfait, nous pouvons toujours revenir à n'importe quelle étape précédente et retraiter à partir de là. "Pré-traitement" est d'effectuer un traitement de préparation et de supprimer anormalement haute intensité pixels causés par rayons-X. «Alignement grossier" produit une série d'inclinaison où chaque image de la projection subséquente de la série d'inclinaison est aligné sur le précédent par corrélation croisée. Nous définissons perles d'or, qui pour l'utiliser comme repères dans la «génération du modèle repères", et le programme suit les marqueurs fiduciaires dans chaque image de la projection et construit "Alignement Fine". "Positionnement Tomogram" permet de culture de la tomographie à Z. "Final Stack alignés" est généré en utilisant une interpolation linéaire, et des fonctions telles que la FCE-correction, l'or-Gomme et 2D de filtrage peut être appliqué sur option. La tomographie est calculée en "Générer Tomogram» par rétro-projection pondérée dans l'espace de Fourier. "Post-traitement» permet de culture de l'tomogramme le XY-région d'intérêt et le contraste d'échelle dans la gamme des structures d'intérêt, et «Clean Up" permet d'effacer les fichiers intermédiaires et libère l'espace disque. VIII. Stockage de la base de données tomogrammes Nous utilisons un basé sur le Web base de données interne pour organiser, stocker, rechercher et diffuser les données tomographiques. Pour chaque série d'inclinaison, on peut enregistrer les détails de l'échantillon, les paramètres de collecte des microscopes, des séries d'inclinaison premières ainsi que la reconstruction 3D associée et de traitement des dossiers d'autres. La page que vous parcourez principale présente une image miniature et une vedette "YouTube" comme le film pour chaque tomogramme, et les entrées peuvent être organisées par la fréquence, le créateur de téléchargement, spécimen type ou par date. Les utilisateurs peuvent rechercher la base de données en entrant des mots clés ou des caractéristiques particulières. Actuellement, plus de 4500 séries d'inclinaison tomographiques ont été déposés dans la base de données, couvrant près de 60 types d'espèces / spécimens, avec un total de plus de 11.000 fichiers associés. IX. Analyse et segmentation de la tomogrammes Les détails structurels de la tomographies peuvent être visualisées et analysées à travers différents logiciels avec des outils de traitement d'image, par exemple spectateur 3dmod des IMOD avec ZAP, XYZ et la fenêtre de trancheuse. La prochaine étape est de créer une segmentation de l'image 3D (tomographie). Une segmentation assigne à chaque voxel (pixel volumétrique) de l'image 3D d'une étiquette décrivant à quelle région ou du matériel du voxel appartient, par exemple, une membrane ou un cytosquelette. Nous utilisons des outils logiciels tels que 3dmod dans IMOD et Amira (imagerie Visage). Bien que certains outils logiciels proposent des modules de segmentation automatique (par exemple, la segmentation de seuil), ils ont souvent ne fonctionnent que pour les images avec un contraste élevé. Les images 3D issus de cryotomography électrons à faible dose ont un faible contraste tels que dans la plupart des cas, nous avons d'attribuer manuellement une étiquette pour chaque voxel. La segmentation est stocké dans un fichier séparé. Il peut être utilisé pour générer un modèle de surface dans laquelle chaque région est représentée par une couleur différente et visualisés en 3D. Les tomographies peut être utilisé pour d'autres analyses. Par exemple, template matching et de calcul ultérieures peuvent fournir des informations statistiques sur le complexe macromoléculaire tels que les ribosomes. L'alignement sous-volume et une moyenne montre des structures de contraste plus élevé et révèle des détails plus fins. X. Faire des films basés sur les tomographies Nous faisons des films pour résumer chaque projet et de donner un tour visuel de nos images tomographiques. Faire un script des fonctionnalités dans les données, nous aimerions montrer et comment rendre ces fonctionnalités. À titre d'exemple, dans un film typique d'un projet de tomographie cellule entière, nous commençons par montrer une série de données représentatives inclinaison et ensuite suivre avec une vue tranche par tranche de l'tomogramme reconstruit. Ensuite, nous montrons une segmentation des macromolécules clé dans la cellule, par exemple, un moteur flagellaire ou un complexe chémorécepteurs ou un filament cytosolique. Enfin, nous concluons avec un modèle montrant une interprétation idéalisée des macromolécules que nous étudions. Logiciels de représentation graphique, comme Amira ou de Chimère sont utilisés pour rendre les images individuelles reste du film. Nous montons souvent des films à partir courts clips pour faciliter les changements à chaque clip. Utilisez un logiciel de montage de film commercial comme Adobe Premiere pour assembler les images fixes dans les clips, et ensuite les clips dans le film final. Nous avons commencé à ajouter une piste audio qui raconte le film. La narration agit comme une «légende de cinéma» et permet au public de se concentrer sur les données présentées tout en regardant le film. XI. Animations Visuelcontes communique sans nécessiter de connaissances du vocabulaire spécifique complexe de domaines scientifiques. Concepts difficiles deviennent simples lorsqu'ils sont accompagnés par une démonstration visuelle. La pratique d'illustrer des idées biologiques avec des dessins animés n'est pas nouvelle. Cependant, seulement dans la dernière décennie ont les outils sophistiqués de création de contenu 3D professionnelle été exercées sur la tâche de construire des animations scientifiques. Il ya maintenant des dizaines de chercheurs activement traduisant les systèmes biologiques dans la dynamique des animations 3D. De nombreuses animations sont beaux présenté sur http://MolecularMovies.org . Ce site héberge également des tutoriels et distribue une trousse gratuite pour manipuler des structures moléculaires d'Autodesk Maya. La suite open source de contenu 3D, Blender, contient plusieurs généré par les utilisateurs importateurs APB. Le processus de fabrication d'une animation 3D implique généralement trois étapes: Modélisation: Nous utilisons un logiciel de représentation graphique à l'exportation des surfaces dans des formats qui peuvent être importés dans Maya. Ces surfaces sont soit des segmentations tomogrammes reconstruite, par exemple, des membranes, de granules, ou de filaments, ou des représentations des surfaces moléculaires. Segmentations Tomogram sont effectuées dans Amira; surfaces moléculaires sont générés en chimère ou VMD. Représentations atomique des molécules peuvent être importés directement dans Maya à partir de fichiers PDB. Une fois les modèles dans Maya, ils peuvent être modifiés, dupliqués, et positionnés comme il convient. Animer: Les animations sont traditionnellement construites par la main, avec l'artiste manuellement la relocalisation des objets en mouvement et l'enregistrement d'une série d'images clés. De nouvelles avancées dans les logiciels graphiques 3D permettent maintenant la dynamique de générer de la procédure, par le biais des modules intégrés et de script API. Rendu: la dynamique de procédure peut offrir des animations convaincantes de la dynamique des processus biologiques, tels que l'auto-assemblage structurel. Pourtant, en raison de la difficulté d'une simulation réaliste des systèmes biologiques, la majorité des animations en 3D sont toujours construites en utilisant les techniques traditionnelles d'images clés. Une fois que la dynamique est dans l'ordre, les annotations visuels, des textures et des effets d'éclairage peuvent être ajoutés. Enfin, la trajectoire de la caméra est choisie et l'animation terminée est rendu dans un film.