Préparation des tissus pour être visualisé sur diapositives Un coloscope peut être passé dans le côlon par l'anus. Un coloscope est un long tube qui a un éclairage et une caméra vidéo à la tête, la capacité de passer de l'air dans le côlon de le faire sauter comme un ballon long pour permettre une meilleure visualisation du côlon, et a un passage pour les pinces à biopsie qui peut s'étendre au-delà de la caméra vidéo pour pincer une zone 3-5 millimètre de la surface "peau" intérieure ou couche muqueuse du côlon pour nous donner un échantillon de biopsie. Les pinces à biopsie peut aussi être utilisé pour enlever éventuellement polypes précancéreux dans le côlon. Nous avons obtenu des biopsies de tissus muqueux colique normale chez les patients, avec le consentement éclairé. Ces patients ont été l'objet d'une coloscopie de dépistage dans une clinique de gastro-intestinal. Notre biopsies ont été placés dans des bocaux de formol. Après 4 heures, le formol a été remplacé par l'alcool à 70%. Échantillons de tissus similaires ont été prises à partir des zones de résections du côlon, enlevée pendant la chirurgie, qui étaient de 1 cm et 10 cm de cancers du côlon ou adénomes avec néoplasie avancée. Ces échantillons de tissus ont également été placés dans du formol, et si les échantillons de tissus ont été grands, certains ont été conservés dans le formol pour une longue période avant d'être placé dans l'alcool à 70%. Les échantillons de tissu sont pris à un laboratoire d'histologie pour être traités et placés dans des blocs de paraffine. Les blocs de paraffine sont refroidis dans un réfrigérateur pour les rendre plus facilement coupé par un microtome. Des sections de tissu de 4 microns d'épaisseur sont découpées dans les blocs de tissus, en utilisant un microtome, et flottait sur l'eau. Pour comparer l'expression des deux protéines, par exemple ERCC1 et PMS2, des coupes de tissus de remplacement peuvent être ramassés sur deux diapositives, jusqu'à il ya trois sections de tissus sur chacun des deux lames. Par exemple, les articles 1, 3 et 5 peut être placé sur une lame étiquetés ERCC1 et les articles 2, 4 et 6 peuvent être placés sur une diapositive étiquetés PMS2. Avoir trois sections de tissus immunocolorées pour une protéine sur une seule lame peut vous permettre de voir si une tendance inhabituelle coloration d'une crypte est un artefact ou est réel, puisque les artefacts ne seraient pas répétées dans plus d'une coupe de tissu sur une lame. Cryptes du côlon sont d'environ 60 microns de diamètre, alors que près de 15 sections de tissus pourraient être réduits grâce à une crypte, et la crypte même chose pourrait être visualisées sur des coupes de tissus multiples par diapositive. Immunocoloration coupes de tissus Les lames sont ensuite soumises à la procédure marquage immunohistochimique. Ceci est une procédure de huit heures, et est assez standard. Les pièces de la procédure que nous utilisons, qui ne sont pas standard, sont l'utilisation de conteneurs Sequenza pour la coloration, et l'utilisation d'une solution pour réduire la coloration de fond appelée "Sniper". Le "sniper" solution est vendu comme une formule exclusive par Biocare médicale, Concord en Californie. Certaines des étapes de nos procédures sont présentées ici. À titre d'exemple, pour PMS2 immunohistochimie, diapositives sont d'abord déparaffinées en plaçant en 3 changements de xylène (3 minutes chacun), suivis par deux changements dans l'éthanol à 100% (2 minutes chacun), suivis par deux changements dans l'éthanol à 95% (2 minutes chacun), suivis par les deux changements d'eau distillée (2 minutes chacun). Ces procédures sont réalisées sous une hotte chimique avec la pression d'air négative de sorte que l'expérimentateur n'est pas exposé à des vapeurs. Lorsque le formol a été initialement utilisée pour fixer le tissu, les pièces des protéines dans l'échantillon de tissu est devenu réticulé. Maintenant nous avons besoin de rompre les liens inter-sorte qu'un anticorps capable de reconnaître la protéine d'intérêt. Les lames sont placées dans une solution tampon qui est amenée à ébullition dans un four à micro-ondes. Il est suivi par 10 minutes sur le réglage moyen, suivi d'un refroidissement pendant 20 minutes sur la glace. Cette étape doit être testé et ajusté pour les micro-ondes différentes, jusqu'à ce que de bons résultats sont obtenus. Notez que pour l'immunocoloration CCOI ou Ku86 nous avons utilisé un tampon citrate de sodium fait avec l'acide citrique + 9 ml de citrate de sodium 41mL + 450mL H 2 O (un tampon, y compris les ions sodium), qui avait un pH d'environ 6,0 pour ERCC1, nous avons utilisé un tampon citrate fait à l'acide citrique 2,1 g + 1 litre H 2 O + ~ hydroxyde de sodium 5 ml d'apporter pH à 6.1 (un tampon avec un minimum d'ions sodium ajouté), et pour PMS2 nous avons utilisé une solution faite avec une solution Antigène Démasquer 5mL (par le vecteur) + 533mL H 2 O. Différents tampons sont nécessaires pour accroître l'interaction des anticorps avec des épitopes des protéines particulières. Les lames sont ensuite mis en peroxyde d'hydrogène à 3% (dilué dans du méthanol) pendant 20 minutes suivie d'un rinçage à l'eau distillée pendant 3 minutes, et lavés dans un tampon phosphate salin (PBS appelé) pendant 5 minutes. Les lames sont ensuite placés dans l'appartement de racks coloration étroit appelé Sequenza (Système Shandon Immunocoloration Sequenza de Thermo Scientific) et rincées avec du PBS. Les diapositives étant immunocolorées pour ERCC1 ou PMS2 sont ensuite exposés à 10 minutes d'exposition à un traitement supplémentaire de 3 gouttes d'une solution propriétaire, obtenu à partir Biocare, appelé «Sniper», qui agit pour réduire la non-coloration des protéines spécifiques de fond. Les lames sont rincées avec un tampon "TBST" qui est de 1 ml + 100 ml de Tween 10x Tris + 900 ml d'eau distillée [où 10x Tris est de 24,2 grammes Trizma + 80 grammes de NaCl + 1000 ml d'eau distillée et déminéralisée + HCl concentré (environ 15 ml) d'apporter la solution à pH 7,6]. Les lames sont ensuite rincés trois fois avec un tampon, et 100 microlitres d'anticorps secondaire biotinylé DAKO au 1:100 dilution (en 2% d'albumine sérique bovine constitué dans le tampon TBST) est ajoutée à la glisse et incubé pendant 30 minutes à température ambiante. À ce stade, Vectastain ABC (avidine biotine) (à partir de Vector Laboratories) réactif est préparé, en utilisant 2,5 ml de PBS, une solution de laisser tomber une, une solution B de chute, et la solution est laissée au repos pendant 30 minutes. Les lames sont rincées 3 fois avec le tampon TBST. Puis 3 gouttes de réactif Vectastain ABC est ajouté et les lames sont incubées à température ambiante pendant 30 minutes, suivi d'un rinçage 2 fois avec TBST. Les lames sont ensuite immergées dans le DAB (diamino-benzamide) (2,9 ml DAB + 400 microlitres de PBS + 250 microlitres du peroxyde d'hydrogène) pendant environ 5 minutes. Les lames sont ensuite rincés 2 fois à l'eau distillée, eau déminéralisée. Contre-coloration est faite avec une solution diluée d'hématoxyline pendant 10 secondes. Les lames sont soigneusement rincés à l'eau du robinet, suivi d'eau déminéralisée. Les lames sont ensuite déshydratées 2 fois pendant 2 minutes dans de l'éthanol à 95%, 2 fois pendant 2 minutes dans de l'éthanol 100% et 2 fois pendant 2 minutes dans le xylène. Un couple de gouttes de Cytoseal XYL (Richard-Allan scientifique) sont ensuite ajoutés à la glisse et une lamelle appliquée. L'évaluation immunohistochimique de ERCC1, Ku86 et CCOI sont effectuées en utilisant le même protocole que pour les PMS2, mais en remplaçant l'anticorps PMS2 avec des anticorps pour ERCC1, Ku86 et CCOI décrites dans le tableau ci-dessous. Évaluation des coupes de tissus pour les cryptes déficient dans l'expression de ERCC1, PMS2, Ku86 et CCOI Nous examinerons d'abord des coupes de tissus sous un Motic (DM-BA300) photomicroscope pour l'expression de ERCC1 et PMS2 dans les cryptes de la muqueuse colique. PMS2 et ERCC1 sont deux enzymes de réparation de l'ADN, et donc ils sont situés là où l'ADN est, dans les noyaux des cellules des cryptes. Ceci est indiqué dans la figure 1, où le colon brune représentant de coloration pour ERCC1, se produit dans les noyaux des cellules dans une crypte. La crypte normale, nous montrons d'abord dans le microscope a été colorées pour ERCC1, et la tache brune montre l'emplacement de ERCC1. Nous rappelons les types de cellules dans les cryptes, où "cellules caliciformes" sont en forme un peu comme un verre de vin, avec des noyaux à une petite région à la base des cellules sur le bord extérieur de la crypte, et un ballonnement article, rempli de granules de mucine blanc dans la partie de la cellule à l'intérieur de la crypte. Les deux autres types de cellules regard un peu comme dans nos sections colorées, et ils sont les entérocytes et cellules entéroendocrines, et leurs noyaux sont également au bord extérieur de la crypte, à la base des cellules. Dans les biopsies prélevées chez des patients qui n'ont jamais eu une néoplasie du côlon, ou dans des biopsies loin de tout site de cancer du côlon, la quasi-totalité des noyaux dans tous les cryptes normales montrent haut niveau d'expression de ERCC1 comme indiqué ici. Pour orienter nos observations, des coupes de tissus obtenus à partir de biopsies de patients atteints de néoplasie du côlon ne sont observés pour des niveaux d'expression de PMS2, ERCC1, CCOI ou Ku86 dans la muqueuse colique normale. Nous pouvons observer tous les cryptes dans une section de tissu normal, avec un objectif 40x, comme nous avons lentement passer par une section de tissu ensemble et souligner les cryptes, les cellules interstitielles, toute nodules lymphoïdes sur la lame, et la musculeuse (si présent dans la biopsie). Nous rappelons également qu'il ya juste plusieurs cellules à la base de la crypte qui sont les cellules souches. Ces cellules souches générer tous les environ 2.000 cellules de la crypte complète. Une cellule souche présentant une mutation ou d'une epimutation peut prendre en charge la niche de cellules souches entier. Puis la crypte l'ensemble peut avoir modifié coloration pour une enzyme d'intérêt (conversion crypte) comme nous le montrons dans cette nouvelle diapositive, où nous voyons les cryptes toute déficientes pour CCOI côté de cryptes qui ont une expression élevée de CCOI. Ensuite, nous montrons une diapositive à partir d'un patient avec un cancer du côlon ou un adénome avec néoplasie avancée. Sur cette diapositive, certains ont des cryptes normales haut niveau d'expression de ERCC1 et certains ont des niveaux inférieurs de l'expression. Tous les cryptes dans la section des tissus sont photographiés à basse résolution avec un objectif 10x, et les images sont carrelées de sorte que la section de tissu entier est vu dans une seule image. Les cryptes sont ensuite numérotées. Les cryptes avec une expression élevée de l'enzyme, typique des cryptes dans les biopsies de loin BOFm toute forme de cancer, sont appelés au niveau «4» coloration. Les autres niveaux sont «0» s'il n'ya pas d'expression détectable, "1" si l'expression à peine détectable est évident, "2" s'il n'y est présent l'expression, mais à un niveau beaucoup plus bas que le niveau 4, et "3" si l'expression est présent à un niveau inférieur à 4, mais assez forte. Nous points chaque diapositive sur le bleu d'image à faible résolution pour 4, vert pour 3, jaune pour 2, orange pour une et rouge pour 0. Ici, nous montrons en passant par une section d'une biopsie à l'aide d'un objectif 40x. Nous parsèment les cryptes de l'image à faible résolution. Figure 1. Une crypte colique montrant une expression élevée de ERCC1 dans les noyaux des cellules des cryptes. Toutes les couleurs de cette image ont été aussi renforcée dans le contraste et la saturation, à l'aide de Paint Shop Pro 5. Les résultats représentatifs Les sections de tissus de remplacement sur des lames séparées nous permettre de regarder les cryptes coliques mêmes, avec une expression de deux protéines différentes montré par immunohistochimie. L'image de l'un coloré crypte pour PMS2 et le teint même crypte pour ERCC1 est indiqué sur les microscopes adjacente avec des écrans d'ordinateur adjacentes. Cela nous permet de déterminer s'il ya carence conjointe de deux protéines ou si les déficiences dans chacune des protéines, alors que chacun est fréquente, se produit de façon indépendante. Nous avons trois sections de tissu par lame, de sorte que toute lacune apparente dans l'expression d'une protéine peut être vérifiée comme étant déficient à plus d'une section, et non due à un artefact. Dans les tissus environnants cancers du côlon, où il ya une anomalie du champ donnant lieu à un cancer, il ya une fréquence élevée des cryptes déficientes pour ERCC1 et PMS2. Nous avons également utilisé l'immunohistochimie pour trouver la fréquence des cryptes déficientes pour Ku86 et CCOI. Sur cette diapositive, nous passons par une section de tissu ensemble immunocolorées pour Ku86, en utilisant un objectif 40x, et nous pouvons voir que quelques cryptes sont déficientes pour Ku86 dans cette section des tissus. De même, sur cette diapositive, nous passons par une section de tissu ensemble immunocolorées pour CCOI, en utilisant un objectif 40x, et nous pouvons voir que seul un nombre modéré de cryptes sont déficientes pour CCOI.