정면 RNA 효소에 의해 지연 복제 포크의 직접 다시 시작

이 방법에 보고된 연구에 사용된 Pomerantz와 오도넬, 과학 327, 590-592 (2010) . 1. 중단 RNAP의 연신율 복잡한 조립은 다음과 같이 수행되었습니다 E. 500 NM 최종 농도 콜리 RNAP 사람은 (20 MM 트리스 – CL (산도 7.5), 8 MM MgCl 2, 0.5 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 5 버퍼 100 μl의 T7A1 모터를 포함하는 biotinylated 3.6 이하 DNA 템플릿 5 NM 최종 농도로 혼합했다 70 σ 37 10 분 MM DTT, 10 % 글리세롤) ° C. APU 40 μm의 GTP, ATP와 CTP의 각 100 μm의는 37 추가 10 분 ° C.에 추가되었습니다 2. streptavidin 비즈에 중단 RNAP의 신장 복합 고정은 다음과 같이 수행되었습니다 streptavidin 자기 코팅 구슬 (Invitrogen) 200 μl는 방 온도에서 10 분 이상 반응 추가되었습니다. 3. 고정 중단 RNAP의 신장 복합 정제는 다음과 같이 수행되었습니다 구슬이 (위에서) 버퍼의 0.9 ML 포함하는 0.75 M NaCl, 200 μg / ML의 헤파린, 20 μg / ML 다음 ssDNA (뜨는은 자기 분리하여 각 세척 단계 후 삭제되었습니다.) 5 번 씻어되었습니다 구슬은 버퍼 A.의 0.9 ML로 2 번 씻어되었습니다 4. :에 정면 RNAP 다음과 같이 수행되었다 하류 상대 복제 포크의 형성 구슬이 (위에서) 뉴잉글랜드 Biolabs 버퍼 4 삽 I (뉴잉글랜드 Biolabs) 10 단위 100 μl에 resuspended되었습니다 것은 37 10 분 추가되었습니다 ° C. 구슬은 버퍼의 0.9 ML 3 번 씻어 후 빠른 T4 결합 반응 버퍼 (뉴잉글랜드 Biolabs) 50 μl에 resuspended되었습니다. 빠른 T4 ligase (뉴잉글랜드 Biolabs) 2 μl는 방 온도에서 10 분 사전 annealed 포크드 DNA 6 nm의 최종 농도 (RP10, RP22, RP25)와 함께 추가되었습니다. 구슬은 버퍼 A.의 0.9 ML 3 번 씻어되었습니다 5. 복제 분기점에서 최고의 스트랜드 합성의 replisome와 개시의 총회는 다음과 같이 수행되었습니다 DnaB (hexamer 등)의 448 pmol는 버퍼의 비즈 150 μl와 incubated되었습니다 (20 MM 트리스 – CL (산도 7.5), 8 MM MgCl 2, 0.5 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산), 5 MM DTT, 10 % 글리세롤) 30 s에 대한 23 ° C. 투표소 III의 4.9 pmol * (폴 III HE 마이너스 β), β 15 pmol, 2 MM ATP, 60 μm의 dGTP 및 dATP 각각 200 μl의 볼륨에 추가 37에서 추가로 5 분 ° C.를 incubated되었습니다 복제가와 함께 10 μg SSB와 24 μm의 dATP와 dTTP 각 추가시 시작되었다 [α – 32 P] dTTP와 [α – 32 P] dCTP (특정 활동, 3,000-5,000 CPM / pmol) 250 마지막 볼륨 μL. 반응 500 MM EDTA (에틸렌 다이아 민 테트라 초산) 12 μl를 추가시 10 분 이후에 종료되었습니다. 6. 정화 및 라디오 레이블이 붙은 DNA 제품의 농도는 다음과 같이 수행되었습니다 반응이 구슬에서 DNA를 제거하기 위해 종료 후에 구슬이 (위에서) 삶은되었습니다. 비즈에 연결된 나머지 잔여 DNA는 50 30 분 10 UL의 볼륨에 proteinase K와 구슬을 치료 ° C.를하여 제거되었습니다 구슬 그런 다음 삶은되었으며 뜨는은 자기 분리에 의해 제거되었습니다. DNA를 포함하는 결합 뜨는은 Qiagen PCR 정리 키트를 사용하여 정화되었다. 라디오 표시 DNA 제품은 다음 알칼리성 아가로 오스 겔에서 분석되었다 정화. 정면 RNAP 신장 복합은 위와 같이 수행되었다 중단 단, σ 70 부재에 * 복제가 생략되었습니다. 대표 결과 : 함께 replisome의 충돌 정면 RNAP 보통 2.5 킬로바이트와 길이 3.6 킬로바이트 두 제품에 발생합니다. 2.5 이하 제품은 중단 RNAP와 RNAP와 충돌시 연기 replisome에서 결과를 분기점에서 DNA의 길이를 나타냅니다. 3.6 이하 제품은 불완전한 RNAP에 의해 모터의 숙박 또는 일부 replisome 정면 RNAP의 읽기를 통해서에서 전체 길이 DNA와 결과를 나타냅니다. 좋은 또는 정확한 결과는 약 50 % 전체 길이 DNA 생산 것을 보여줍니다. 그러나, 경우에 RNAP에 의해 모터의 적은 인가 발생하고 전체 길이의 DNA보다 높은 비율이 replisomes의 큰 인구 이후 관찰된 것은 정면에 RNAP가 발생하지 않습니다. 단 전체 길이 DNA (3.6 KB)에서 중단 RNAP 결과의 부재에 복제. 그림. 1 replisome는 정면에서 RNAP에 의해 장애가 있습니다. (A) 실험 설정은. E. 안부나는 중단 연신율 복잡한는 이전에 설명한대로 T7A1 발기인 (9)를 포함하는 biotinylated DNA를 조립했다 RNAP. 간단히 중단 연신율 복합은 더욱 10 분 APU, GTP, ATP와 CTP의 또한 다음 10 분 biotinylated DNA와 RNAP의 holoenzyme을 잠복기로 모터 20 BPS 하류를 형성했다. Streptavidin 비즈는 다음 비즈가 0.75M NaCl, 200 MG / ML 헤파린, 100 nm의 단일 스트랜드 불안정 RNAP – DNA의 단지 및 초과 NTPs를 제거하는 DNA를 포함하는 버퍼의 0.9 ML, 5 번 각각 씻어 줄 추가 10 분 추가되었습니다 . DNA는 다음 SAPI와 소화, 세탁 및 사전 annealed 포크드 DNA에 출혈도 잡았습니다. 구슬은 replisome의 조립하기 전에 다시 한번 씻어되었습니다. 발기인은 분기점에서 2.5 킬로바이트에 위치하고 분기점으로 직접 전송하는 방향입니다. (B) DnaB는 다음 replisome 조립했을 추가되었습니다 및 복제는 존재하거나 시작 (레인 2) 또는 부재 (레인 1)되었습니다 정면 RNAP.