复制叉停滞了迎头RNA聚合酶直接重新启动

使用这种方法是在报告的研究，科学327，590-592（2010）波默朗茨和奥唐奈 。 1。大会暂停的RNA聚合酶伸长复杂如下： 500 nm的终浓度的大肠杆菌大肠杆菌 RNA聚合酶σ70，他是5纳米的生物素标记的3.6 kb的DNA模板含有100μL缓冲液（20毫米的Tris – CL（pH值7.5），MgCl 2的8毫米，0.5毫米EDTA，5 T7A1发起人的最终浓度混合MM数码地面电视，10％甘油）为10分钟，在37 ° C。 APU和40微米的GTP，ATP和CTP的100微米添加一个额外的10分钟在37 ° C 2。停止RNAP伸长复杂固定到链霉亲和素珠是执行如下： 200μL和素磁性包被的磁珠（Invitrogen公司），分别加入上述反应在室温为10分钟。 3。固定的停止RNAP伸长复杂的纯化步骤如下： 珠（从上面）洗净，用0.9缓冲液含0.75 M氯化钠，200微克/ ml肝素，和20μg/ ml的单链DNA（上清每个磁分离洗涤步骤后删除。）接下来，5倍珠洗2次，用0.9毫升缓冲液A 4。形成一个复制叉下游相对头对RNA聚合酶如下： 重悬于100μLNew England Biolabs公司缓冲区4和10个单位SAP我（New England Biolabs公司）珠（从上面）10分钟添加37 ° C。珠子用0.9毫升缓冲液A洗3次，然后重悬于50μL快速T4连接反应缓冲液（New England Biolabs公司）。 2μL快速T4连接酶（New England Biolabs公司）随着6纳米预退火分叉DNA终浓度在室温为10分钟（RP10，RP22，RP25）。珠洗3次，用0.9毫升缓冲液A 5。大会的复制体，并在复制叉的领先链合成的起始执行如下： DnaB（六聚体）的448 pmol珠150缓冲液孵育（20毫米的Tris – CL（pH值7.5），8 毫米氯化镁2，0.5毫米EDTA，5毫米的数码地面电视，10％甘油）30秒时23 ° C。 4.9 pmol *第三的波尔（波尔三，他减去β），15 pmolβ，ATP的2毫米，60微米dGTP和dATP的分别加入200μL的体积和进一步的5分钟，37℃孵育复制开始后，一起加入10微克SSB和24微米的dATP和dTTP [α- 32 P] dTTP的和[α- 32 P] dCTP（具体活动，3,000-5,000 CPM / pmol）终体积为250微升。反应终止后10分钟后，加入12μL500毫米EDTA。 6。的分离纯化和浓度的放射性标记的DNA产品如下： 珠（从上面），煮沸后终止反应，以消除珠DNA。删除任何剩余的DNA，其余珠，珠治疗的蛋白酶K，10 UL量为30分钟，在50 ° C。珠子，然后煮和磁分离上清液删除。合并后的上清液含有DNA纯化使用Qiagen公司PCR清理套件。纯净放射性标记的DNA产品，然后在碱性琼脂糖凝胶电泳分析。 *在头RNA聚合酶停止伸长复杂如上，但是，σ70的情况下复制被省略。 代表性的成果： 头部碰撞与复制体RNA聚合酶通常在两种产品的长度为2.5 kb和3.6 KB结果。 2.5 kb的产品，暂停从复制体RNA聚合酶和拖延后，碰撞与RNA聚合酶的叉长度的DNA。 3.6 kb的产品，要么不完整，入住的RNA聚合酶启动子或部分复制体的RNA聚合酶头通读全长度的DNA和结果。一个良好的或准确的结果表明，约50％的全长DNA产生。然而，在某些情况下会出现少占用由RNA聚合酶启动子和一个完整长度的DNA的比例更高，因为一个更大的replisomes人口是观察不遇到迎头的RNA聚合酶。复制的唯一完整长度的DNA（3.6 KB）在停止RNAP结果的情况下。 图。 1复制体是阻碍了头的RNA聚合酶 。 （一）实验装置。一个E。 COL我RNA聚合酶停止伸长复杂生物素标记的DNA包含如前所述T7A1发起人（9）组装。简单地说，一个停止伸长复杂所形成的孵化与生物素化DNA的RNA聚合酶全酶的APU，GTP，ATP和CTP此外还有10分钟的10分钟20 BPS下游发起人。链霉亲和素珠，添加额外的10分钟然后珠洗5次，每0.9毫升含0.75米，200 mg / ml的肝素，氯化钠和100 nm的单链DNA，以消除不稳定的RNA聚合酶- DNA复合物和多余的NTPS缓冲区。的DNA，然后与SAPI消化，水洗，结扎预退火分叉的DNA。珠被冲洗一遍之前的复制体大会。 （二）DnaB是那么的复制体组装和复制发起的存在（2巷）或缺乏（1巷）发起人是位于2.5 kb和前叉是面向对叉的直接转录。 RNA聚合酶。