에어 - 상 Electroolfactogram 기록을 사용하여 마우스 강한 감각 뉴런의 분석 응답

1 부. EOG 녹음 설정 레코딩 장치는 기록 전극, 기준 전극, 공기 공급 튜브, 표본의 무대, 그리고 해부 현미경, 모든 패러데이 케이지 내에서 공기 테이블에 정박로 구성되어 있습니다. Micromanipulators는 전극의 배치 및 공기 공급 튜브에 사용됩니다. 지속적인 공기 흐름은 공기 배달 튜브를 통하여 및 표본을 통해 전달하기 전에 습도를 추가하는 증류수로 부풀어 오른 모양이다. 6-8밀리미터의 깊이 Sylgard 가득 60mm 문화 요리는 표본에 대한 마운트 표면으로 사용됩니다. 잘하고 채널은 전기적 수정 링어의 솔루션을 통해 표본에 대한 참조 전극을 연결하는 수단을 제공하기 위해 장착 접시에 Sylgard 밖으로 빈입니다. 기록 전극과 참조 전극은 앰프에 연결됩니다. 앰프의 신호는 컴퓨터에 다음 디지타이저로 전송하고 있습니다. 이러한 Axograph 또는 pClamp 같은 소프트웨어는 신호를 기록하고, 응답의 후속 분석을, 자극 프로토콜을 제어하는​​ 데 사용할 수 있습니다. 앰프 뒤에 연결된 오실로 스코프 기록 전극을 배치하면서 전기 잠재력을 실시간 모니터링과 EOG 녹음하는 동안 편리하게하실 수 있습니다. odorant의 자극의 전달은 신호 수집에 사용되는 같은 컴퓨터에 연결된 Picospritzer에 의해 제어됩니다. Picospritzer에있는 공기 압력은 10 PSI로 설정됩니다. 하나의 공기 탱크와 레귤레이터는 공기 테이블과 Picospritzer 모두에 공기를 공급하는 데 사용할 수 있습니다. 두 번째 공기 탱크와 레귤레이터는이 낮은 압력과 공기의 큰 금액을 필요로 humidified 공기 흐름을 위해 공기를 제공하는 데 사용됩니다. 직전 odorant의 자극을 제공하기 위해 Picospritzer 출력은 odorant 병에 연결됩니다. odorant 병은 다음 공기 공급 튜브에 연결되어 있습니다. 2 부 : 준비 전극 기록 전극은 모세가 수정 링어의 솔루션 (135 MM NaCl, 5 MM KCl, 1 MM CaCl 2, 1.5 MM MgCl 2, 10 MM HEPES, 필터는 살균 산도 7.4)로 가득 가져온 유리에 chlorided 실버 와이어입니다. 참조 전극은 chlorided 은색 와이어입니다. 전극 홀더에 은색 와이어를 설치합니다. 기록 전극의 경우, 와이어 1~2센티미터은 전극 홀더의 끝 부분에서 내다해야합니다. 더 선은 참조 전극에 대해 남아있을 수 있습니다. 실버 와이어에 AgCl 겉옷을 추가하려면, 0.1 M NaCl에서 와이어를 위치와 1.5-9 V DC 전원 소스의 긍정적인 단자에 전극 홀더를 연결합니다. 전원의 단자는 전기 0.1 M NaCl 용액에 연결되어 있어야합니다. 10 분 동안 진행 chloriding 반응을 허용합니다. 녹음 및 참조 전극 사이에 정전기를 맞춰야하기 위해 짧게 녹음 장치에 설치하기 전에 함께 전극을 만지지. 유리 micropipette의 풀러를 사용하여 모세관 당겨. 모세관의 끝에 개통은 직경 50-10 미크론 주위해야합니다. 그것은 은색 와이어보다 ~ 2cm 이상 때​​문에 모세관의 뭉툭한 끝을 점수와 끊다에 다이아몬드 연필을 사용합니다. 화재 – 폴란드어 부탄 토치로 잘라 끝을. 수정 링어의 용액에 0.5 % 아가로 오스를 용융. 전송 피펫을 사용하여 전극의 끝부분에 용융 아가로 오스 솔루션의 작은 금액을 당기세요. 수정 링어의 솔루션 (이 목적을 위해 유용 온수와 긴 얇은 끝을을 가지고 뽑아왔다 주사기)를하는 방법 1 / 2에 대한 뽑아 모세를 입력합니다. 부드럽게하는 기포를 이동시키다하는 모세관이 끄적. 그들이 사용할 준비가 될 때까지 아래에 수정된 링어의 솔루션의 소량으로 저장 병에 가득 전극을 저장합니다. 조직 샘플 준비 및 녹음을위한 준비가되면, 기록 전극 와이어를 통해 채워진 모세관을 설치합니다. 3 부 : 준비 odorant 솔루션 odorants의 아밀 아세테이트와 heptaldehyde 큰 반응을 보여주고과 EOG 각성제 등 때문에 좋은 선택입니다. microcentrifuge 튜브에서 디메틸 sulfoxide (DMSO)에 odorant의 dilutions 일련의 준비를합니다. 복용 – 반응 곡선의 시작점으로, 5 M 5-10 배 dilutions을 준비 × 10 -6 M. 매일 신선한 dilutions하십시오. 또한 실리콘 stoppers과 이온스 병의 4.9 MLS의 물과 DMSO 100 μL 희석 주식을 혼합하여 물에 50 배 odorants를 희석. 솔루션은 적어도 30 분 동안 병에 평형하자. 각 병에 odorants의 증기 농도가 알 수없는 것을 참고, 그러나 액상에서 odorants의 농도의 함수로 달라질 수 있습니다. p로 실리콘 마개를 통해이 18 게이지 바늘을 삽입rovide 입력 및 출력 포트. 병 사용하지 않을 때는 포트 연결해야합니다. 파트 4 : EOG와 분석 데이터를 기록 잘린 다음 CO 2 안락사 또는 마취 과다 복용하여 마우스를 희생. 두개골을 overlying 피부를 제거하고 sagittally 정중선을 따라 머리를 두 갈래로 갈라지다. 장착 접시에 머리 절반, 중간 측면을 탑재합니다. 조심스럽게 turbinates을 폭로하기 위해 심장을 제거합니다. 녹화 무대에 탑재 조직과 접시를 놓습니다. turbinates의 기록 위치가 현미경 중심 있도록 무대를 맞춥니다. turbinate 표면에 humidified 공기를 제공하기 위해 공기 탱크를 켭니다. 위치 공기 공급 튜브 있도록 그것이 약 10mm 떨어진 녹음 위치에서이다. 유속은 ~ 600 ML / 분입니다. 로우 패스 1 kHz에서에서 필터와 100X에서 이득과 DC 모드 (AC 증폭은 EOG 신호의 유물을 유발합니다)에 앰프를 설정합니다. micromanipulators에 마운트 녹화 및 참조 전극. 장착 접시에 잘으로 참조 전극을 절감하고 그것이 전기 조직에 연결되어 그러한 수정 링어의 솔루션을 커버. turbinate IIB 또는 III의 표면에 기록 전극을 신중하게 낮추십시오. 전극 겨우 후각 상피의 표면을 만지지해야합니다! 전극이 상피 접촉되면 (즉 전기 회로를 완료) 직선 기준은 오실로 스코프에 표시됩니다. 공기 공급 튜브의 측면 포트에 odorant 병을 연결합니다. 컴퓨터에서 자극 프로토콜을 시작합니다. 데이터 수집에 대한 샘플링 속도는 2 kHz에서 이상되어야합니다. 이 소프트웨어는 냄새 펄스를 트리거하고 녹음을 시작합니다. 전형적인 자극 프로토콜 100 밀리초 펄스가 1 초 간격으로 구분하여 결합하여 100 밀리초 기간 단일 펄스, 또는 10 초 지속 펄스 수 있습니다. 조직이 최소한 적응하므로 프로토콜 사이의 시간을 허용합니다. 한 분 아밀 아세테이트와 최대 10 -3 M에 heptaldehyde의 액체 농도에 충분이며 높은 농도에서 5 분 수 있습니다. 높은 악취 농도 (예 : 복용 – 반응 곡선의 끝에 등) 제공 후 잔여 냄새는 튜브에 남아있을 수 있습니다. 95 % 에탄올과 공기 튜브를 세척 및 추가 조직 샘플을 계속하기 전에 건조. Axograph 소프트웨어는 EOG 신호의 주요 매개 변수를 측정하기위한 도구를 제공합니다. 이러한 매개 변수는 응답 진폭, 대기 시간, 최대 시간과 종료 시간 상수를 포함합니다. 그것은 디지털 자세한 분석을하기 전에 25 Hz에서에서 흔적을 필터링하는 것이 바람직하다 수 있습니다. 대표 결과 그림 1. 분석 EOG에 대한 매개 변수입니다. EOG의 일부 매개 변수는 응답 진폭, 대기 (자극이 시행하고 반응이 시작되었을 때 사이의 시간), 상승 시간 (시작 사이의 시간을 포함하여 생쥐 사이에 반응의 비교에 대해 특히 유용합니다 응답 및 피크), 최대 시간 (자극의 시작에서 응답의 피크에 시간), 그리고 종료 일정 시간 (τ, 하나의 지수 방정식에 대한 응답의 붕괴 단계를 피팅에 의해 결정 ). 이러한 지연 시간, 상승 시간 및 종료의 지속 시간 운동 매개 변수의 비교 들어, 이전에 분석하기 위해 응답의 최대 진폭을 정상화하는 것이 좋습니다. 그림 2. 대표 다른 자극 프로토콜에 따라 신호를 EOG. 자극에 대한 응답으로 마우스 EOGs의 (A) 예가 아밀 아세테이트의 농도 증가와 함께. 패널의 상단에있는 검은색 라인은 odorant의 자극의 타이밍과 기간을 나타냅니다. 전설의 농도는 액체 용액의 농도입니다. (B) 선량 – 반응 관계 다섯 생쥐에서 평균. 오차 막대는 95 % 신뢰 간격입니다. 최대 진폭의 감소는 종종 매우 높은 악취 농도에서 관찰됩니다. (C) 이점 – 펄스 자극에 대한 응답으로 EOG의 예제. odorant의 하나의 짧은 펄스가 몇 초 동안 지속적인 적응을 elicits. (D) 10 초에 대한 응답으로 EOG의 예제는 odorant의 자극을 인정합니다. EOG는 지속 odorant 프레 젠 테이션 도중 desensitization을 보여줍니다.